趙 華，樊龍星，張朝正

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

殼寡糖是一類(lèi)由氨基葡萄糖（glucosamine，GLcN）和N-乙酰-氨基葡萄糖（N-acetyl glucosamine，GLcNAc）通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接的低聚糖（聚合度為2～10），通常是由甲殼素和殼聚糖經(jīng)過(guò)化學(xué)法、物理法和酶法等水解得到的[1]。殼寡糖具有分子質(zhì)量低，易被人體吸收，水溶性好和吸濕保濕等[2-3]優(yōu)于殼聚糖的特性，因此可用于制備飼料[4]和保鮮材料[5-7]等生物制品。殼寡糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力[8-9]、抗氧化[10-12]、抗腫瘤[13-14]、螯合重金屬[11]以及促進(jìn)植物抗逆和促進(jìn)生長(zhǎng)[15]等都強(qiáng)于殼聚糖的生物活性。

因此，殼寡糖的制備已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。目前，制備殼寡糖的方法有化學(xué)法、物理法和酶解法?；瘜W(xué)法制備殼寡糖存在后期分離純化降解產(chǎn)物難度大，消耗試劑多和處理復(fù)雜等缺點(diǎn)[16]。物理法存在底物利用率低和降解產(chǎn)物得率低等缺點(diǎn)[17]。酶解法因其殼寡糖產(chǎn)量高和酶特異性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛關(guān)注，但也存在試驗(yàn)成本高、反應(yīng)條件嚴(yán)格和實(shí)用性差等缺點(diǎn)[18]。

本研究利用蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）產(chǎn)殼聚糖酶，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)酶解法制備殼寡糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而提高殼寡糖的產(chǎn)量，以便進(jìn)一步為殼寡糖的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）：由天津科技大學(xué)微生物菌株保藏中心保藏，保藏編號(hào)為T(mén)CCC 150018。

1.1.2 化學(xué)試劑

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）、殼聚糖（脫乙酰度80%～95%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基葡萄糖鹽酸鹽（分析純）：北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖10 g/L，調(diào)pH值為6.0～6.4，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉16 g/L，葡萄糖11.5 g/L，K2HPO41.4 g/L，KH2PO40.6 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，吐溫-80 1.2 g/L，NaCl 5.0 g/L，調(diào)pH值為6.0～6.4，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；H1850高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 殼聚糖酶制備

每50 mL種子培養(yǎng)基接入一環(huán)蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），在30 ℃、160 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，得到種子液。以4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min的條件下發(fā)酵48 h，得到發(fā)酵液。

發(fā)酵液8 000 r/min離心5 min除去菌體，在上清液中加入（NH4）2SO4，不斷攪拌使發(fā)酵液中的（NH4）2SO4飽和度達(dá)到60%，靜置2 h后，4 ℃、10 000 r/min離心15 min除去雜蛋白，再取上清液，加入（NH4）2SO4使其飽和度達(dá)到80%，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，倒掉上清液，收集沉淀，得到殼聚糖酶，用蒸餾水定容至20 mL，4 ℃儲(chǔ)藏。

1.3.2 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考李燕等[19]的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，繪制氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 殼寡糖含量的測(cè)定

1%膠體殼聚糖溶液：稱(chēng)取1 g殼聚糖（脫乙酰度80%～95%）于燒杯中，量取20 mL蒸餾水?dāng)嚢枞苊? min，加入30 mL濃度為0.2 mol/L的醋酸溶液，搖勻，待溶液透明，用0.2 mol/L的醋酸鈉調(diào)pH至5.5，蒸餾水定容至100 mL。

殼寡糖含量測(cè)定采用DNS法。每個(gè)比色管加入0.8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液，另取殼聚糖酶粗酶液0.1 mL于比色管中，空白對(duì)照加入0.1 mL滅活酶液，再向各試管中加入1 mL 1%的膠體殼聚糖溶液，在35 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，然后實(shí)驗(yàn)組沸水浴10 min，定容比色管中溶液至2 mL，再加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，以空白組為對(duì)照，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定各試管的吸光度值。按照氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算酶解液中殼寡糖含量。

1.3.4 殼聚糖酶的添加量

按照1.3.3的方法，分別加入0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL和0.25 mL的殼聚糖酶粗酶液，計(jì)算酶解液中殼寡糖含量，確定最佳殼聚糖酶添加量。

1.3.5 單因素試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

殼寡糖的產(chǎn)量受到酶解pH、溫度、時(shí)間和殼聚糖的濃度等條件的影響，本研究以最終殼寡糖的產(chǎn)量（Y）為考察指標(biāo)，分別以酶解pH值（3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6），酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃），殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）和酶解時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）為影響因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察單因素對(duì)殼寡糖的產(chǎn)量的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖酶解條件

通過(guò)單因素試驗(yàn)初步考察最佳酶解pH值（X1）、酶解溫度（X2）、底物濃度（X3）以及酶解時(shí)間（X4）對(duì)殼寡糖產(chǎn)量（Y）的影響。然后利用Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以波長(zhǎng)520 nm處的吸光度值（x）為橫坐標(biāo)，氨基葡萄糖的濃度（y）為縱坐標(biāo)，繪制氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y=12.719 0x+0.607 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997，二者線性關(guān)系良好，可用于測(cè)定殼寡糖的含量。

圖1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucosamine

2.2 殼聚糖酶的最佳添加量

考察最佳殼聚糖酶的添加量對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響，如圖2所示。由圖2可知，在殼聚糖酶的添加量為0.5～2.0 mL時(shí)，隨著殼聚糖酶添加量的增加，殼寡糖產(chǎn)量隨之增多；當(dāng)酶液添加量為2.0 mL時(shí)，殼寡糖產(chǎn)量最大，但是當(dāng)酶液添加量＞2.0 mL后，隨著添加量的增多，殼寡糖的產(chǎn)量幾乎不再變化。因此，殼聚糖酶最佳的添加量為2.0 mL。

圖2 殼聚糖酶添加量對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of chitosanase addition on chitosan oligosaccharide yield

2.3 殼聚糖酶酶解條件優(yōu)化

2.3.1 酶解pH值對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響

酶的活性受pH的影響主要是pH會(huì)使酶的活性中心發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，會(huì)解離酶的中心結(jié)構(gòu)基團(tuán)，限制酶與底物的結(jié)合，pH還決定氨基在反應(yīng)體系中形成R-NH2或R-NH3+[20]。考察殼聚糖酶在pH為3.6～5.6的酶解效率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶解pH值對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis hydrolysis pH on chitosan oligosaccharide yield

由圖3可知，酶解pH為3.6～4.0時(shí)，殼聚糖酶受pH影響較大，幾乎不降解殼聚糖；當(dāng)酶解pH值為4.0～5.6，隨著pH值的增大，殼寡糖的產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)pH達(dá)到5.6時(shí)，降解效果達(dá)到最佳；當(dāng)酶解pH值＞5.6時(shí)，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絮狀不溶物質(zhì)，又會(huì)影響酶解效率。因此，酶解pH值為5.6為宜。

2.3.2 酶解溫度對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響

酶解溫度對(duì)酶的影響在于酶解溫度過(guò)低會(huì)降低酶的活性，影響酶解反應(yīng)的進(jìn)行。酶解溫度適合，酶會(huì)達(dá)到最佳酶解效果。當(dāng)溫度再持續(xù)升高，一定程度會(huì)導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失活，一般溫度對(duì)酶活性的影響呈現(xiàn)出鐘罩形[21]。不同酶解溫度對(duì)殼聚糖酶降解能力影響結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)酶解溫度為30～50 ℃時(shí)，殼寡糖的含量隨著酶解溫度的升高而升高；當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，殼寡糖含量最高，為16.603 μmol/mL；當(dāng)酶解溫度高于50 ℃之后，殼寡糖含量隨著酶解溫度升高而降低。因此，殼聚糖酶降解的最佳溫度為50 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis hydrolysis temperature on chitosan oligosaccharide yield

2.3.3 底物濃度對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響

不同殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下殼聚糖酶降解能力結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～2.0%時(shí)，隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，殼寡糖產(chǎn)量也增多；當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，殼寡糖產(chǎn)量最高；當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞2.0%之后，殼寡糖產(chǎn)量隨之下降。因此，最佳的殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%。

圖5 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of chitosan mass fraction on chitosan oligosaccharide yield

2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of enzymolysis hydrolysis time on chitosan oligosaccharide yield

不同酶解時(shí)間對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在酶解時(shí)間為30～150 min時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，殼寡糖產(chǎn)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增多；當(dāng)酶解時(shí)間為150 min時(shí)，殼寡糖產(chǎn)量最大，但是當(dāng)酶解時(shí)間＞150 min后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，殼寡糖的產(chǎn)量幾乎不再變化。因此，殼聚糖酶降解殼聚糖的最佳酶解時(shí)間為150 min。

2.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖酶酶解條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 10.0 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，考察最佳酶解pH值（X1）、酶解溫度（X2）、底物濃度（X3）以及酶解時(shí)間（X4）對(duì)殼寡糖產(chǎn)量（Y）的影響，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化和響應(yīng)面分析，所得試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken experiments

通過(guò)Design Expert V10.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到的多元二次回歸方程為：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知，該模型P值＜0.000 1，極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P=0.928 6＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，即模型和試驗(yàn)擬合較好。模型決定系數(shù)R2為0.990 4，校正后模型的決定系數(shù)為0.980 9，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為1.785 0%，表明該模型只有1.785 0%的變異不能由該模型解釋?zhuān)旁氡葹?4.056 9，說(shuō)明試驗(yàn)操作與模型可信。在該模型中一次項(xiàng)X1、X2、X3、X4、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)X2X3、X2X4對(duì)殼寡糖產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)X1X2對(duì)殼寡糖產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）；交互項(xiàng)X1X3、X1X4、X3X4對(duì)殼寡糖產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05）。

2.3.6 響應(yīng)面分析

綜上所述，該模型可用于解釋試驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行預(yù)測(cè)，由回歸分析和回歸方程擬合可以繪制出各因素相互作用的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，殼聚糖最佳酶解條件為酶解pH值5.66、酶解溫度53 ℃、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.09%、酶解時(shí)間157 min，該條件下殼寡糖產(chǎn)量理論值可達(dá)35.81 μmol/mL。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面分析的可靠性，考慮到殼聚糖溶解度的問(wèn)題，將pH值調(diào)至5.6，并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，反應(yīng)終止后殼寡糖濃度可達(dá)35.73μmol/mL，與模型預(yù)測(cè)值35.48μmol/mL接近。

圖7 各因素交互作用對(duì)殼寡糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on chitosan oligosaccharide production

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)殼聚糖酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最優(yōu)酶解條件：酶解pH值為5.6，酶解溫度為53℃，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.09%，酶解時(shí)間為157 min。在此優(yōu)化條件下，殼寡糖的產(chǎn)量為35.73 μmol/mL，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明所建模型可以很好的預(yù)測(cè)殼寡糖的產(chǎn)量。