劉一平，金黎明*，王曉彤，俞 勇，鄭 立，宮小明

（1.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605；2.中國極地研究中心，上海 200136；3.自然資源部第一海洋研究所，山東 青島 266061；4.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 濰坊 261041）

海洋微生物生存于廣闊的海洋，其生存環(huán)境具有低溫、缺氧、高壓、寡營養(yǎng)、高鹽、低/無光照等特殊性，有更大的可能產(chǎn)生區(qū)別于常見的陸生微生物的結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特的活性物質(zhì)，因此成為化學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

目前，對海洋微生物的生物活性研究涉及到抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗污損和酶抑制等，涉及到的海洋微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌等[1-5]。其中，對海洋細(xì)菌抗菌作用的研究已有一些報(bào)道，主要物種有芽孢桿菌（Bacillus）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、粘細(xì)菌（Haliangium）、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）和海洋單胞菌（Marinomonas）等[6]。如王琦等[7]從連云港海域的海水中分離得到一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GM-1，其對油菜菌核病菌（Sclerotinia scleotiorum）和白色念珠菌（Candida albicans）都有較強(qiáng)的抗菌作用，其中對白色念珠菌的抑菌帶寬度為3.95 cm。張興鋒等[8]采用對峙生長法從紅樹內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株海洋解淀粉芽孢桿菌CⅢ-1，其對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cubense）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）等動植物病原菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗作用。李德全等[9]從海藻中分離獲得的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）NH-8對草莓灰霉病有很好的抑制效果。薛珊珊等[10]從硇洲島和徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)潮間帶采集海水和沉積物標(biāo)本，從106株海洋細(xì)菌中篩選出44株具有抗菌活性的菌株，其中31株對枯草芽孢桿菌具有拮抗作用，11株對金黃色葡萄球菌具有拮抗作用，13株對大腸埃希氏菌（Escherichia coli）具有拮抗作用。JIN L M等[11-16]得到了多株具有抗菌活性的海洋微生物。但是，目前對不常見海域—北冰洋來源的海洋微生物的研究較少。

本試驗(yàn)以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、白色念珠菌、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）等多種食源性致病菌為指示菌，擬從北冰洋海域沉積物樣品中分離篩選出一株對多種食源性致病菌具有廣譜抗菌性的海洋細(xì)菌，并通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。然后，以菌株發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌圈直徑大小作為響應(yīng)值，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件，以期獲得最佳的培養(yǎng)條件和更多的活性代謝產(chǎn)物，為今后繼續(xù)研究該菌株的活性代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

沉積物樣品：中國第六次北極考察的北冰洋沉積物樣品。

銅綠假單胞菌（PAO1）、白色念珠菌（SN250）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、鼠傷寒沙門氏菌（CICC21484）、大腸埃希氏菌（ECMCC44102）、鮑曼不動桿菌（BNCC194496）、屎腸球菌（BNCC336951）、肺炎克雷伯氏菌（BNCC186113）：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、瓊脂、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；氯化鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB海水培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂20 g，氯化鈉10 g，海水1 L，pH 7.0。液體培養(yǎng)基中不加入瓊脂。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH 7.0。

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：18 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH 7.0。

腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基：38.5 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH 7.0。

MRS培養(yǎng)基：52.2 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH 7.0。以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3020-濕熱高壓滅菌器：日本SANYO公司；SW-OJ-2FD潔凈工作臺：中國蘇州安泰安氣技術(shù)有限公司；Rota vapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；HWY111型恒溫培養(yǎng)振蕩器：中國智誠分析儀器制造公司；MT-180B生化恒溫培養(yǎng)箱：中國上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；3×32-well聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Applied Biosystems ProFlex公司。

1.3 方法

1.3.1 北冰洋來源細(xì)菌的分離和純化

北冰洋來源細(xì)菌的分離采用涂布平板法。稱取0.5 g北冰洋沉積物樣品，加入4.5 mL陳海水，混勻后靜置2 h。再取0.5 mL此樣品加入4.5 mL陳海水中，以此類推，配制成10-7～10-4稀釋濃度的樣品50 μL，涂布于LB海水培養(yǎng)基平板。28 ℃條件下培養(yǎng)1～2 d，獲得單菌落。挑取單菌落，采用平板劃線法純化菌株，并進(jìn)行編號。

1.3.2 抑菌譜的測定

將保藏的菌株劃線于LB海水固體培養(yǎng)基上，37 ℃活化12 h，挑取單菌落接種于裝有100 mL LB海水培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)1 d，獲得種子液。

將種子液按0.1%（V/V）的接種量接種到200 mL LB海水培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，取上清。然后50 ℃旋蒸至干，加入3 mL超純水，用0.22 μm無菌濾膜過濾濃縮液，得到粗發(fā)酵液。

采用瓊脂擴(kuò)散法[12]測定發(fā)酵液對8種病原微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、屎腸球菌和鮑曼不動桿菌）的抑菌活性，篩選獲得廣譜抗菌海洋細(xì)菌。

5種常見病原微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌）應(yīng)用LB培養(yǎng)基；肺炎克雷伯菌應(yīng)用NB培養(yǎng)基；鮑曼不動桿菌應(yīng)用BHI培養(yǎng)基；屎腸球菌應(yīng)用MRS培養(yǎng)基。

1.3.3 廣譜抗菌海洋細(xì)菌的鑒定

形態(tài)觀察及生理生化鑒定：參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[18]對廣譜抗菌海洋細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：將篩選出的菌株接種于LB海水培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)36 h。采用煮沸法[19]提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3'）對菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 1.0 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixture 1.0μL，rTaq酶（5U/μL）0.25μL，引物27F（10μmol/L）1.0μL，引物1492r（10 μmol/L）1.0 μL，10×Loading Buffer 4.0 μL，無菌雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株的分類地位。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：將篩選菌株按1%接種量接種于LB海水培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h，初始pH值為7.0。采用瓊脂擴(kuò)散法分別測定菌株對白色念珠菌的抑菌活性，測3次，取平均值。采用單因素輪換法依次考察發(fā)酵溫度（29 ℃、31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃）、初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、轉(zhuǎn)速（140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min）對菌株抗白色念珠菌活性的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，選取培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、初始pH值（C）、轉(zhuǎn)速（D）為考察因素，設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)[20-21]，以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平，各因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation condition optimization

利用Design-expert.V 8.0.6軟件對所得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，首先得到多元二次回歸方程，然后根據(jù)回歸方程進(jìn)一步繪制響應(yīng)面立體分析圖，最后根據(jù)分析結(jié)果，確定菌株的最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 北冰洋來源細(xì)菌的分離和純化結(jié)果

從北冰洋沉積物樣品中共篩得140個單菌落。

2.2 抑菌譜的測定結(jié)果

通過測定抑菌譜發(fā)現(xiàn)，52號菌株對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌都有一定的抑制作用，為一株廣譜抗菌的菌株，其抑菌效果見表2。

表2 52號菌株抑菌譜測定結(jié)果Table 2 Determination results of antimicrobial spectrum of strain NO.52

由表2可知，52號菌株對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的抑菌活性較強(qiáng)，抑菌圈直徑為17～22 mm；對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏桿菌的抑菌活性較弱，抑菌圈直徑為12～17 mm；而對鮑曼不動桿菌及屎腸球菌無抑菌作用。

2.3 52號菌株的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

52號菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可見，52號菌株的菌落呈微隆起的圓形，顏色呈黃白色，無褶皺；細(xì)胞呈短桿狀。

圖1 52號菌株的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colonial (a) and cell (b) morphology of strain NO.52

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果

52號菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，革蘭氏染色、硝酸鹽試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)結(jié)果均呈陽性；甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)和尿素試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。因此，初步鑒定52號菌株為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表3 52號菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain NO.52

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

52號菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，52號菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，將52號菌株鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 基于16S rDNA基因序列52號菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain NO.52 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)時(shí)間、溫度、初始pH值及轉(zhuǎn)速對52號菌株抗白色念珠菌活性的影響見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)條件對52號菌株抗白色念珠菌活性的影響Fig.3 Effect of different culture conditions on anti-Candida albicans activity of strain NO.52

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH值及轉(zhuǎn)速的增加，抑菌圈直徑均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH值及轉(zhuǎn)速分別為72 h、37 ℃、6.5、180 r/min時(shí)，抑菌直徑均達(dá)到最大，分別為25.81 mm、25.52 mm、27.91 mm、27.83 mm。因此，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH值及轉(zhuǎn)速分別為72 h、37 ℃、6.5、180 r/min。

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of Box-Behnken tests

續(xù)表

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

應(yīng)用Design-Expert.V 8.0.6軟件對表4的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到抑菌圈直徑（Y）對自變量培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、初始pH值（C）以及轉(zhuǎn)速（D）的二次回歸方程：Y=27.95+2.17A+0.66B-0.20C-0.16D+0.74AB+0.33AC-0.18AD+0.16BC+0.093BD+0.44CD-4.02A2-3.59B2-2.28C2-1.66D2。

由表5可知，模型的P值＜0.01，極顯著，說明模型構(gòu)建成功，能反應(yīng)響應(yīng)值的變化。失擬項(xiàng)P值＞0.05，不顯著，說明回歸方程擬合效果較好，模型選擇恰當(dāng)。決定系數(shù)R2=0.9760，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.953 6，說明該模型的預(yù)測值與實(shí)際值具有較好的擬合性，可以用此模型對抑菌圈直徑進(jìn)行預(yù)測。各因素對抑菌圈直徑影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，其中一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B及交互項(xiàng)AB對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而其他項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。應(yīng)用Design-Expert.V 8.0.6軟件，繪制響應(yīng)面立體分析圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，響應(yīng)面開口朝下，響應(yīng)值隨著各自變量值的增大先增大后減小，存在最大值，且交互作用AB影響顯著。

通過Design-Expert.V 8.0.6軟件對模型進(jìn)行優(yōu)化求解，得到52號菌株的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間75.38 h、培養(yǎng)溫度36.24 ℃、培養(yǎng)基初始pH值6.29、轉(zhuǎn)速178.71 r/min，預(yù)測的抑菌圈直徑為32.56 mm?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將最佳培養(yǎng)條件修訂為培養(yǎng)時(shí)間75 h、培養(yǎng)溫度36 ℃、培養(yǎng)基初始pH值6.5、搖床轉(zhuǎn)速178 r/min。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，52號菌株對白色念珠菌抑菌直徑達(dá)到30.23 mm，與預(yù)測理論值相對誤差較小，說明回歸模型預(yù)測值具有良好符合性，結(jié)果可信。

圖4 各因素交互作用對52號菌株抗白色念珠菌活性的影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of interaction between each factors on anti-Candida albicans activity of strain NO.52

3 結(jié)論

從北冰洋沉積物樣品中分離篩選出一株廣譜抗菌的52號菌株，其對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌均有一定的抑制作用，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36 ℃、培養(yǎng)時(shí)間75 h、培養(yǎng)基初始pH值6.5、轉(zhuǎn)速178 r/min。在此最優(yōu)培養(yǎng)條件下，52號菌株對白色念珠菌的抑菌圈直徑為30.23 mm。