何元方陳艷琴楊濤張召輝劉曉斌，4

作者單位：716000延安 1延安大學醫(yī)學院；710038西安 2空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院疼痛科；221004徐州 3徐州醫(yī)科大學附屬淮海醫(yī)院普通外科；716000延安 4延安大學附屬醫(yī)院檢驗科

腎透明細胞癌（renal clear cell carcinoma，RCCC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的85%～90%［1］。目前RCCC尚缺乏有效的早期篩查手段，約30%的患者在診斷時已發(fā)生轉移［2］。由于晚期患者的手術治療效果不佳，轉移性RCCC患者的5年生存率＜10%［3］。因此，迫切需要進一步開發(fā)針對RCCC的新型分子診斷和預后評估的生物標志物。線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)是細胞代謝和功能的關鍵控制者。研究表明線粒體Ca2+信號的異?？纱龠M多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。目前有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體鈣離子攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）在卵巢癌、結腸癌和前列腺癌中異常表達，且與腫瘤進展密切相關［5-8］，但其是否可作為RCCC預后標志物仍需進一步研究。本研究通過分析MICU1在RCCC組織中的表達及其與總生存期的關系，旨在闡明MICU1在RCCC中的作用。

1 材料和方法

1.1 標本來源

收集2016年1月—2018年12月于延安大學附屬醫(yī)院行根治性腎切除術的RCCC患者的石蠟包埋切片30例，同時選取距離腫瘤邊緣5 cm以上且經病理檢查無癌細胞的癌旁組織為對照?；颊呒{入標準：⑴經病理證實為RCCC；⑵術前未接受化療或放療。排除在研究期間接受藥物治療以及合并其他惡性腫瘤或其他重大疾病者。本研究經延安大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

RCCC細胞株CAKI-1購自中科院上海細胞庫；MICU1真核表達質粒和干涉片段由空軍軍醫(yī)大學生理與病理學教研室提供；胎牛血清購自BBI Life Sciences公司；青鏈霉素混合液購自中國索萊寶公司；RPMI 1640培養(yǎng)基及DMEM高糖培養(yǎng)基購自中國瑞博公司；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen公司；MTS細胞活力檢測試劑盒購自美國Promega公司；β-actin抗體購自北京天德悅公司；MICU1抗體，羊抗兔二抗購自美國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒購自中國Beyotime公司；EdU試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；免疫組織化學SP染色試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3 免疫組織化學法檢測MICU1在RCCC組織的表達

將RCCC病理切片置于烤箱中，68℃處理20 min，常規(guī)脫蠟，采用檸檬酸高壓修復抗原，PBS沖洗，山羊血清37℃封閉20 min，滴加MICU1（1∶1 000稀釋）一抗孵育2.5 h，PBS沖洗3次；DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片顯微鏡下閱片。根據陽性細胞所占比例及陽性細胞染色強度計算染色實驗結果。陽性細胞所占比例＜10%計0分，11%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。陽性細胞染色強度：陰性染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分，褐色計4分。結果 由2位病理技術人員在每張切片中隨機計數(shù)5個高倍視野（×200）進行分析。

1.4 基于TCGA數(shù)據庫分析MICU1 mRNA在RCCC中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

利用TCGA（https：//cancergenome.nih.gov/）搜索并下載RCCC表達譜數(shù)據，排除缺失臨床參數(shù)和生存資料患者，最終獲得517例RCCC組織的RNAseq數(shù)據及對應的患者臨床數(shù)據。按照中位數(shù)法將RCCC樣本分為高表達組（RCCC表達水平≥17.6）和低表達組（RCCC表達水平＜17.6），分析其與臨床病理特征及預后的關系。采用Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis）分析MICU1 mRNA表達與RCCC患者預后的關系。

1.5 細胞培養(yǎng)和轉染

CAKI-1細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱條件下培養(yǎng)。按每孔約5×105個細胞鋪種于6孔板，恒溫培養(yǎng)24 h，細胞密度至80%左右轉染，轉染試劑采用LipofectamineTM2000。采用瞬時轉染法分別將MICU1干涉片段和MICU1過表達質粒轉染到CAKI-1細胞中，標記為siMICU1組和MICU1組；同時設置相應的陰性對照，標記為siCtrl組和EV組。

1.6 Western blot法檢測MICU1蛋白的表達

收集對數(shù)生長期的CAKI-1細胞，PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液，冰上孵育20 min，在4℃下12 000 r/min離心30 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定MICU1蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。按每孔55μg上樣，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移至PVDF膜，在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入一抗MICU1抗體（1∶1 000）和β-actin抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜；加羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL顯影。采用ImageJ軟件對Western blot條帶進行灰度分析，蛋白表達量=目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值。實驗重復3次。

1.7 MTS法檢測CAKI-1細胞的生長情況

取對數(shù)生長期的CAKI-1細胞，以2×103/孔細胞密度加入96孔板，于5% CO2、37℃下孵育24 h；顯微鏡觀察，每孔加入20μL MTS溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，記錄數(shù)據記為0 d，同樣方法分別于1 d、2 d、3 d、4 d檢測剩余4板樣品孔OD值并記錄，繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。

1.8 EdU實驗檢測CAKI-1細胞的增殖能力

取對數(shù)生長期細胞，以4×104/孔接種于24孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用細胞培養(yǎng)液1∶1 000稀釋EdU A液至50μmol/L，每孔加入500μL稀釋后的溶液，37℃孵育2 h，PBS清洗細胞2次，加500μL 4%的多聚甲醛溶液固定25 min，PBS洗滌2次；加入500μL 2 mg/mL甘氨酸孵育5 min，PBS洗滌2次；加入500μL 0.5% TritonX-100的PBS，脫色搖床孵育10 min，PBS洗滌2次；加入提前配置好的EdU工作液500μL避光孵育30 min，加入滲透劑后分別用甲醇和PBS洗滌；加1×Hoechst33342反應液染細胞核，熒光顯微鏡拍照計數(shù)。實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用配對t檢驗比較RCCC組織及其癌旁正常組織中MICU1蛋白表達水平的差異；采用χ2檢驗分析MICU1蛋白表達水平與各臨床病理參數(shù)間的關系；采用Kaplan-Meier以及Log-rank檢驗進行生存分析；采用Cox回歸分析MICU1表達水平與RCCC患者預后的關系。以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MICU1蛋白在RCCC組織中的表達

免疫組織化學法檢驗結果顯示，MICU1表達于細胞漿，且RCCC組織中MICU1的陽性表達評分低于癌旁正常組織［（4.4±0.8）分vs（11.8±1.0）分，t=5.856，P＜0.001）］，見圖1。

圖1 MICU1蛋白在RCCC組織中的表達Fig.1 Expression of MICU1 protein in RCCC tissues

2.2 基于TCGA數(shù)據庫分析MICU1 mRNA表達與RCCC患者臨床病理特征的關系

TCGA數(shù)據庫分析結果顯示，MICU1表達與性別、TNM分期有關（P＜0.05），但與年齡無關（P＞0.05），見表1。

2.3 基于TCGA數(shù)據庫分析MICU1表達與RCCC患者生存的關系

TCGA數(shù)據庫分析結果顯示，MICU1高表達患者未達到中位死亡人數(shù)，MICU1低表達組中位生存期為71.3個月（95%CI：62.8～79.6個月），兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=19.290，P＜0.001），見圖2。

圖2 MICU1表達與RCCC患者總生存期的關系Fig.2 Relationship between expression of MICU1 and overall survival in RCCC patients

2.4 基于TCGA數(shù)據庫分析影響RCCC患者預后的因素

單因素Cox回歸分析，年齡、TNM分期、MICU1表達可能與RCCC患者預后有關（P＜0.05）；多因素Cox回歸分析結果，MICU1低表達是影響RCCC患者總生存的獨立危險因素（HR=1.641，95%CI：1.191～2.261，P=0.002）。見表2。

2.5 構建MICU1干涉和過表達細胞株

Western blot檢測結果顯示，siMICU1組MICU1蛋白表達水平低于siCtrl組（t=5.985，P=0.004），見圖3A；MICU1組MICU1蛋白表達水平高于EV組（t=3.482，P=0.025），見圖3B。說明過表達和干涉的MICU1細胞均構建成功，可用于后續(xù)MICU1細胞生物學功能研究。

表1 MICU1表達與RCCC患者臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between expression of MICU1 and clinicopathological features in RCCC patients

2.6 干涉和過表達MICU1對RCCC細胞生長的影響

MTS實驗結果顯示，siCtrl組和siMICU1組轉染第4天對應的OD值分別為0.746±0.021和1.267±0.027，差異有統(tǒng)計學意義（t=15.110，P=0.001），見圖4A；EV組和MICU1組轉染第4天對應的OD值分別為0.903±0.038和0.620±0.034，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.587，P=0.005），見圖4B。

表2 影響RCCC患者總生存期的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of overall survival in patients with RCCC

圖3 Western blot檢測CAKI-1細胞中MICU1蛋白的表達Fig.3 Expression of MICU1 protein in CAKI-1 cells detected by Western blot

圖4 MTS實驗檢測干涉和過表達MICU1對RCCC細胞生長的影響Fig.4 Effects of inter ference and overexpression of MICU1 on the proliferation of RCCC cells detected by MTS assay

2.7 干涉和過表達MICU1對RCCC細胞增殖的影響

EdU實驗結果顯示，siMICU1組和siCtrl組的細胞增殖率分別為（0.436±0.014）%和（0.288±0.019）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.307，P=0.003），見圖5A；MICU1組和EV組的細胞增殖率分別為（0.231±0.007）%和（0.319±0.021）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.014，P=0.016），見圖5B。

圖5 EdU實驗檢測干涉和過表達MICU1對RCCC細胞增殖的影響Fig.5 Effects of interference and overexpression of MICU1 on the proliferation of RCCC cells detected by EdU assay

3 討論

基因治療是目前腫瘤治療領域的研究熱點，是一種新的治療理念，其通過對某些腫瘤基因進行特殊處理，再導入細胞，從而抑制癌細胞的發(fā)生與發(fā)展，發(fā)揮靶向治療的作用［9］。迄今為止，關于線粒體鈣攝取蛋白的基因功能、蛋白表達及生理特性等方面的研究較多，研究表明MICU1在不同腫瘤中表達不同。MARCHI等［7］在人類結腸癌腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)MICU1的表達水平較癌旁正常組織低。WANG等［10］研究亦發(fā)現(xiàn)MICU1在肝癌組織中呈低表達。本研究亦發(fā)現(xiàn)MICU1在RCCC組織中表達水平降低。然而，CURRY等［11］卻發(fā)現(xiàn)雌激素受體陰性基底樣乳腺癌中MICU1表達上調，這可能與不同腫瘤組織來源不同有關。另外，多項研究表明，MICU1表達與患者預后相關，如在乳腺癌中MICU1低表達與患者不良預后相關［12］，而在卵巢癌中MICU1高表達與患者較低整體存活率有關［5］。本研究通過分析517例RCCC患者癌組織中MICU1表達與患者生存的關系，發(fā)現(xiàn)MICU1低表達患者的中位生存期低于高表達患者，與MICU1在乳腺癌作用一致，低表達的RCCC患者預后較差。

本研究還進一步在RCCC細胞中干涉MICU1表達，發(fā)現(xiàn)RCCC細胞生長和增殖能力顯著增強，反之過表達MICU1后，細胞生長和增殖能力顯著受抑制。然而，目前就MICU1促進RCCC細胞增殖的機制尚未闡釋。有研究證實MICU1是MCU的負向調節(jié)因子［13］，在結直腸癌中MCU表達升高可促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，其機制是線粒體鈣水平的增加及促進腫瘤細胞能量代謝［14］。而金明朋等［15］也發(fā)現(xiàn)鈉鈣交換體NCLX表達降低可導致線粒體鈣水平升高，進而促進肝癌細胞增殖和抑制凋亡。另有學者［16］報道MICU1的表達缺失可誘導線粒體鈣超載，進而促進腫瘤進展，并產生化療藥物抗性。MARCHI等［7］研究發(fā)現(xiàn)在HeLa細胞中干涉MICU1可促進細胞增殖，而過表達MCIU1抑制細胞增殖，其中也伴隨著HeLa細胞中線粒體鈣水平的升高。由此可見，MICU1表達下降導致的線粒體鈣水平升高可能是MICU1低表達促進RCCC細胞增殖的機制之一。此外，MICU1表達下降還可促進腫瘤細胞的糖酵解過程［5］以及ROS生成增加［16］，進而促進卵巢癌的進展，這些也可能是MICU1促進RCCC細胞增殖的原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MICU1在RCCC組織中呈低表達，MICU1低表達是影響RCCC患者總生存期的獨立危險因素，MICU1低表達可促進RCCC細胞增殖能力。但由于本研究樣本量及臨床特征數(shù)據收集有限，故上述結論仍需擴大樣本量進一步驗證，目前MICU1促進RCCC細胞生長和增殖的分子機制亦有待闡明。