呂炳樺鐘路陽黃俏俏李科志胡榜利謝明智

作者單位：530021南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院化療科

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，結(jié)腸癌是結(jié)直腸癌的一種重要類型，發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)［1］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度＞200 bp的核苷酸，具有廣泛的基因表達(dá)調(diào)控非編碼RNA分子。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA異常表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可能作為診斷和預(yù)后評(píng)估的特異性分子標(biāo)志物［2-3］。SH3PXD2A（SH3 and PX domains 2A）基因是PX結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員，與肝癌、卵巢癌等發(fā)病密切相關(guān)［4］，但lncRNA SH3PXD2A-AS1在結(jié)腸癌中的作用未明確。本研究收集結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本并檢測(cè)lncRNA SH3PXD2A-AS1的表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)腸癌的預(yù)后判斷尋找新的指標(biāo)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2017年1月至2018年10月的40例結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織（距離癌灶邊緣3 cm范圍內(nèi)）。其中男性17例，女性23例；腫瘤原發(fā)于左半結(jié)腸19例，右半結(jié)腸21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)病理診斷為結(jié)腸癌；⑵術(shù)前未接受局部或系統(tǒng)治療（如免疫治療和靶向治療等）；⑶術(shù)后化療方案為XELOX（奧沙利鉑+卡培他濱）。排除合并其他腫瘤、免疫性疾病、嚴(yán)重肝腎功能損傷、感染等患者。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA SH3PXD2AAS1的表達(dá)水平

RNA提取試劑盒購自凱杰公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自BIOMIGA公司，熒光定量PCR儀購自美國AB公司。根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照熒光定量PCR試劑盒說明書配制20μL體系PCR反應(yīng)混合液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。PCR引物序列：GAPDH正向引物序列為5'-CCAAGGAGTAAGACCCCTGG-3'，反向引物序列為5'-TGGTTGAGCACAGGGTACTT-3'；SH3PXD2A-AS1正向引物序列為5'-AGGGAGGGGAGAGAGAATGT-3'，反向引物序列為5'-TGCATGGGGAGACAAGGATT-3'。讀取目的lncRNA及內(nèi)參的循環(huán)閾值（Ct值），采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 觀察指標(biāo)及隨訪

收集患者年齡、性別、腫瘤位置、TNM分期、臨床分期、生存時(shí)間等臨床資料，TNM分期根據(jù)第八版美國腫瘤聯(lián)合會(huì)（AJCC）癌癥分期手冊(cè)［5］。

以門診復(fù)診或隨診、電話或電子郵件等方式進(jìn)行隨訪，每隔1～3個(gè)月隨訪1次，隨訪截至2019年5月10日。隨訪時(shí)間為10～26個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為18個(gè)月。以患者死亡、失訪或最后隨訪時(shí)間為終點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)存活、死亡、失訪人數(shù)?？偵嫫诙x為自患者入組開始至因任何原因死亡的時(shí)間。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)驗(yàn)證

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）下載有關(guān)結(jié)腸癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床表型數(shù)據(jù)，采用R語言（版本：3.5.1）提取lncRNA SH3PXD2A-AS1數(shù)據(jù)，分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特征關(guān)系采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法計(jì)算累積生存率，并采用Log-rank法檢驗(yàn)生存曲線的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SH3PXD2A-AS1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，lncRNA SH3PXD2A-AS1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織（6.53±1.62 vs 4.37±0.96，t=3.445，P=0.002），見圖1。

2.2 lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平的中位數(shù)（7.53）將患者分為SH3PXD2A-AS1高表達(dá)組和SH3PXD2A-AS1低表達(dá)組，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤位置、T分期和N分期無關(guān)（P＞0.05），與M分期、臨床分期有關(guān)（P＜0.05），其中M1期和Ⅲ～Ⅳ期患者中l(wèi)ncRNA SH3PXD2A-AS1的表達(dá)水平分別高于M0期和Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05）。見表1。

圖1 lncRNA SH3PXD2A-AS1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA SH3PXD2A-AS1 in colon cancer tissues

表1 lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationship between the expression of lncRNA SH3PXD2AAS1 and the clinical features of colon cancer patients［n（%）］

2.3 lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者總生存期的關(guān)系

本研究無失訪患者，隨訪期間死亡3例（7.5%）。Kaplan-Meier生存分析顯示，SH3PXD2A-AS1高表達(dá)組1年、2年累積生存率分別為95.1%、85.3%，SH3PXD2A-AS1低表達(dá)組分別為100.0%、87.0%。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組患者生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.326，P=0.586），見圖2。

圖2 結(jié)腸癌患者的生存曲線Fig.2 Survival curves in patients with colon cancer

2.4 基于TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示，結(jié)腸癌組織469例，癌旁正常組織41例，患者平均年齡（67.8±23.7）歲，lncRNA SH3PXD2A-AS1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織（t=8.523，P＜0.001），見圖3A；lncRNA SH3PXD2A-AS1在M1期患者中的表達(dá)水平高于M0期（t=2.351，P=0.032），見圖3B；以lncRNA SH3PXD2AAS1表達(dá)水平的中位數(shù)（7.128）為界值，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，結(jié)果顯示兩組患者總生存期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.442，P=0.930），見圖3C。分析lncRNA SH3PXD2A-AS1表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特征顯示，SH3PXD2A-AS1表達(dá)與腫瘤的M分期和臨床分期有關(guān)（P＜0.05），但與其他臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05），見表2。

圖3 基于TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證lncRNA SH3PXD2A-AS1D在結(jié)腸癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系Fig.3 Expression of lncRNA SH3PXD2A-AS1 in colon cancer and its relationship with prognosis based on TCGA database

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證lncRNA SH3PXD2A-AS1的表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.2 The relationship between the expression of lncRNA SH3PXD2A-AS1 and the clinical features of colon cancer patients using TCGA database［n（%）］

3 討論

lncRNA具有廣泛的生物學(xué)功能，可參與染色體修飾、基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀調(diào)控及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等過程［6］。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA異常表達(dá)與多種疾病的病理、生理過程密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中l(wèi)ncRNA也發(fā)揮重要作用，既可參與調(diào)控腫瘤的發(fā)病過程，也可以作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷指標(biāo)［7-8］。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中亦伴隨多個(gè)lncRNA的異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的lncRNA在腫瘤形成過程中發(fā)揮促癌或抑癌作用［9-10］。既往已有研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與結(jié)腸癌發(fā)病密切相關(guān)的lncRNA。魏琳琳等［11］發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-AS1在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)量高于癌旁組織和結(jié)腸上皮細(xì)胞，且與結(jié)腸癌TNM分期相關(guān)，高表達(dá)患者術(shù)后5年生存率較低。ZENG等［12］報(bào)道lncRNA PVT1可通過抑制miR-216a-5p表達(dá)發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等作用。也有研究分析lncRNA在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及其臨床意義［13-14］，這些研究表明lncRNA在結(jié)腸癌發(fā)病中有重要作用，可能作為治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中的lncRNA SH3PXD2A-AS1的表達(dá)水平在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，提示lncRNA SH3PXD2A-AS1有可能發(fā)揮促癌作用，與范鈺等［15］在胃癌的研究中的結(jié)果一致。進(jìn)一步的臨床分析顯示lncRNA SH3PXD2A-AS1在M1期患者中的表達(dá)高于M0期，在Ⅲ～Ⅳ期患者中的表達(dá)水平也比Ⅰ～Ⅱ期患者高，提示lncRNA SH3PXD2A-AS1高表達(dá)可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，表達(dá)量越高，腫瘤越易發(fā)生轉(zhuǎn)移。本研究搜索TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)結(jié)腸癌數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，亦得到相似的結(jié)果。既往也有研究報(bào)道lncRNA SH3PXD2A-AS1在其他腫瘤如卵巢癌［16］、胰腺癌［17］和結(jié)直腸癌［4］等中的作用。MA等［4］研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SH3PXD2A-AS1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，且lncRNA SH3PXD2A-AS1過表達(dá)與結(jié)直腸癌的腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，敲除lncRNA SH3PXD2A-AS1后可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。BAYARMAGNAI等［18］在乳腺癌中的研究也顯示，過表達(dá)lncRNA SH3PXD2A-AS1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，與本研究結(jié)果一致，均提示lncRNA SH3PXD2A-AS1可能是促癌基因。然而在預(yù)后方面，本研究臨床資料和TCGA數(shù)據(jù)均顯示高表達(dá)和低表達(dá)lncRNA SH3PXD2A-AS1患者生存時(shí)間差異不明顯。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA SH3PXD2A-AS1在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，尤其在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者中表達(dá)更高，因此有望作為判斷結(jié)腸癌進(jìn)展程度的指標(biāo)。但本研究樣本量較少，隨訪時(shí)間亦較短，因此尚待進(jìn)一步明確lncRNA SH3PXD2A-AS1在結(jié)腸癌中的作用。