陳琳呂炎何文龍胡晶范婧瑩何迎春，

作者單位：410208長(zhǎng)沙1湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院；3中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護(hù)工程技術(shù)研究中心

我國(guó)鼻咽癌發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平［1］。放療或同步放化療是鼻咽癌主要的治療手段［2］。早期鼻咽癌治療效果較好，但晚期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者療效不理想，因此亟需尋找鼻咽癌效的治療藥物［3］。研究表明中藥在鼻咽癌治療中可取得一定的效果［4-5］。漢黃芩素是從黃芩干燥根莖中提取的一種黃酮類化合物，有抗癌、利尿作用，可通過(guò)多種途徑抗腫瘤活性［6］。體外抗鼻咽癌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可通過(guò)作用于蛋白GSK-3beta和DeltaNp63抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］，但具體的作用機(jī)制未明確。本研究采用不同濃度漢黃芩素作用鼻咽癌CNE2細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、調(diào)亡的影響及并初步探討可能的作用機(jī)制，為漢黃芩素用于鼻咽癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

鼻咽癌CNE2細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。漢黃芩素購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司。胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，Bcl-2、Bax抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，一抗Survivin、XIAP、β-actin、PCNA購(gòu)自美國(guó)CST公司，熒光二抗（鼠抗、兔抗）購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，熒光雙染流式細(xì)胞儀Cellometer Image Cytometer（K2）購(gòu)自Nexcelom公司，實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀購(gòu)自艾森生物科技公司；多功能熒光成像Odyssey CLx購(gòu)自Gene有限公司。

1.2 鼻咽癌CNE2細(xì)胞培養(yǎng)與分組

鼻咽癌CNE2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用DMSO溶解漢黃芩素粉末制成母液，分裝后避光凍存于-80℃冰箱。實(shí)驗(yàn)分為不同濃度（2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L）漢黃芩素組和溶劑對(duì)照組（加入DMSO溶解母液）。

1.3 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況

將50μL培養(yǎng)液加入專用板，放入儀器，每孔初始值相同。取出板子向每孔加入200μL單細(xì)胞懸液（4×103/孔），實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況。當(dāng)細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）達(dá)到1.0時(shí)，暫停監(jiān)測(cè)，取出板子，吸出200 mL培養(yǎng)液，再向每孔加入200μL液體，每組3個(gè)復(fù)孔。按順序放入實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)。以CI值表示細(xì)胞增殖情況，CI計(jì)算公式：CI=（Rn-Rb）/15。用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀繪制不同藥物濃度及時(shí)間作用下的細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)曲線圖。結(jié)合IC50值決定漢黃芩素的作用時(shí)間和濃度，進(jìn)行后續(xù)流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

將細(xì)胞消化重懸后接種于培養(yǎng)皿，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE2細(xì)胞并分別用10.0μmol/L、20.0μmol/L漢黃芩素作用，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。48 h后收集細(xì)胞，再加入2 mL PBS，1 000 r/min離心10 min，吸取上清液。重復(fù)離心3次，加入Annexin-V FITC和PI混合液，避光染色15 min，用移液槍將細(xì)胞懸液混勻，吸取20μL細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞術(shù)專用板，用熒光雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算每組細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)

處理各組細(xì)胞48 h后，PBS清洗3次，冰上裂解40 min后提取總蛋白，用BCA定量法定量，恒流電泳、恒壓轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉后分別加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗脫后加入熒光二抗（鼠抗用于β-actin，兔抗用于其余蛋白），室溫避光孵育2 h，洗脫后以多功能熒光成像系統(tǒng)Odyssey CLx顯影蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參，各蛋白相對(duì)表達(dá)量=各蛋白條帶灰度值/β-actin的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)（以對(duì)照組為參照）。以α=0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響

2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L漢黃芩素作用鼻咽癌CNE2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖抑制率分別為20.3%、23.7%、33.4%、40.9%，IC50值為42.41μmol/L；36 h后細(xì)胞增殖抑制率分別為18.0%、22.0%、36.1%、40.5%，IC50值為34.46μmol/L；48 h后細(xì)胞增殖抑制率分別為7.4%、20.2%、35.0%、40.9%，IC50值為22.81μmol/L，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度漢黃芩素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Wogonin on proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells

2.2 漢黃芩素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡的影響

10.0μmol/L、20.0μmol/L漢黃芩素處理鼻咽癌CNE2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為（17.92±0.93）%和（20.56±0.59）%，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率均為（5.10±0.14）%，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.710，P=0.001；t=43.934，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

2.3 漢黃芩素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

10.0μmol/L和20.0μmol/L漢黃芩素處理鼻咽癌CNE2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，20.0μmol/L漢黃芩素作用的鼻咽癌CNE2細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；抗凋亡相關(guān)蛋白Survivin、XIAP的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；見(jiàn)圖3A；10.0μmol/L和20.0μmol/L漢黃芩素作用時(shí)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)均降低（P＜0.05），而促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3B。

圖2 不同濃度漢黃芩素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Wogonin on apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells

圖3 漢黃芩素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Wogonin on proliferation-and apoptosis-related protein expression of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩具有良好的抗腫瘤作用［7-8］。在人肝癌細(xì)胞中漢黃芩素可通過(guò)抑制MMP-9表達(dá)而抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲［9］，亦可影響卵巢癌細(xì)胞增殖［6］。在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可通過(guò)Akt途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬和凋亡，具有增殖抑制作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度漢黃芩素在48 h內(nèi)均可抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖，且細(xì)胞增殖抑制率隨濃度和作用時(shí)間增加而增大。漢黃芩素作用CNE2細(xì)胞48 h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率與24 h、36 h相當(dāng)，但I(xiàn)C50值（22.81μmol/L）明顯小于24 h、36 h，因此選擇10.0μmol/L和20.0μmol/L漢黃芩素作用48 h為實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)一步行流式細(xì)胞術(shù)觀察漢黃芩素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)濃度藥物均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明漢黃芩素能抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PCNA是一種DNA聚合酶輔助蛋白，可促進(jìn)DNA復(fù)制與修復(fù)，促使腫瘤細(xì)胞增殖［11］。有研究報(bào)道PCNA表達(dá)與鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。Survivin是抗凋亡蛋白家族中最小的成員，具有抗凋亡及促進(jìn)增殖作用，且表達(dá)于多條維持腫瘤存活的信號(hào)傳導(dǎo)通路。在體外抗鼻咽癌CNE2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)沉默Survivin基因可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13-14］。XIAP也是一種抗凋亡蛋白，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其可增強(qiáng)S18鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲能力［15-17］。Bcl-2蛋白是原癌基因Bcl-2的表達(dá)產(chǎn)物，具有抗細(xì)胞凋亡作用，在鼻咽癌中表達(dá)陽(yáng)性率可達(dá)80%。Bax是凋亡蛋白家族的一員，可通過(guò)與Bcl-2競(jìng)爭(zhēng)而調(diào)控細(xì)胞凋亡，在競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程形成的同源二聚體（Bax/Bax）可通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而異源二聚體（Bax/Bcl-2）是細(xì)胞生存信號(hào)之一［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)Bax/Bcl-2比例可促進(jìn)鼻咽癌6-10B細(xì)胞惡性增殖，抑制細(xì)胞凋亡［20］。阿司匹林亦可通過(guò)降低Bcl-2表達(dá)水平和提高Bax表達(dá)水平而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。綜上可見(jiàn)，鼻咽癌細(xì)胞增殖及凋亡與增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。因此，本研究在10.0μmol/L、20.0μmol/L漢黃芩素作用的鼻咽癌CNE2細(xì)胞中觀察增殖相關(guān)蛋白PCNA、抗凋亡相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、Bcl-2以及促凋亡蛋白Bax的表達(dá)情況，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)20.0μmol/L漢黃芩素能顯著抑制Survivin、XIAP表達(dá)，但10.0μmol/L漢黃芩素作用影響不明顯；在10.0μmol/L和20.0μmol/L漢黃芩素作用下，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量均顯著升高，而抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯降低，即Bcl-2/Bax比值大幅下調(diào)，提示漢黃芩素可能通過(guò)下調(diào)抗調(diào)亡相關(guān)蛋白及上調(diào)促凋亡蛋白而抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素可能通過(guò)抑制Survivin、XIAP、Bcl-2表達(dá)并促進(jìn)Bax表達(dá)而發(fā)揮抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，但具體通過(guò)何種細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控有待進(jìn)一步研究，且僅觀察漢黃芩素在體外對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞株的作用，漢黃芩素在體內(nèi)及對(duì)其他鼻咽癌細(xì)胞株的作用亦有待進(jìn)一步研究。