孟亮羅才奎戴小琴陶亮劉山王躍飛

作者單位：430071武漢 武漢市第三醫(yī)院/武漢大學附屬同仁醫(yī)院1神經(jīng)外科，2120救治中心，3胸外科

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，3年生存率僅為5%［1］。腦膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells，GSC）具有自我更新能力，是導致腫瘤復發(fā)、耐藥及治療失敗的關(guān)鍵因素［2-3］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是在細胞增殖、分化、凋亡和應激反應中參與細胞內(nèi)信號傳導的蛋白激酶。MAPK激活可介導GSC自我更新、腫瘤啟動和放射抗性形成，是腦膠質(zhì)瘤進展和治療抗性形成的重要步驟［4］。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶（mitogen-activated protein kinase phosphatase，MAP）受MAPK磷酸酶（MAPK phosphatases，MKPs）家族調(diào)控，能使保守基序中的蘇氨酸和酪氨酸殘基去磷酸化，從而抑制其活性。MKP-1是MKPs家族中功效最高，研究最深入的MAPKs磷酸酶。研究發(fā)現(xiàn)MKP-1在卵巢癌、肺癌及乳腺癌等發(fā)生發(fā)展和化療耐藥中起重要作用［5-6］。然而，MKP-1在腫瘤干細胞及腦膠質(zhì)瘤中的作用未知。組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACi）是一類新的抗腫瘤藥物，能促進未分化的癌細胞分化成熟。HDACi在GSC和腫瘤組織中均可發(fā)揮抗腫瘤作用，但HDACi的抗腫瘤機制尚未明了，且在不同腫瘤細胞中的抗癌機制不完全相同［7-8］。本研究探討MKP-1對HDACi殺傷腦膠質(zhì)瘤干細胞的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集武漢市第三醫(yī)院神經(jīng)外科2016年1月至2018年12月收治的53例腦膠質(zhì)瘤患者的惡性膠質(zhì)瘤組織及相應健康腦組織。納入標準：⑴經(jīng)組織學或細胞學檢查確診為世界衛(wèi)生組織定義的Ⅳ期膠質(zhì)瘤患者；⑵未接受放療、化療。排除合并精神性疾病，合并心、肺等其他主要臟器功能障礙，自身免疫疾病，以及嚴重營養(yǎng)不良患者。其中男性35例，女性18例，年齡41～69歲，平均年齡（57.3±11.3）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

DMEMF12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素購自美國Hyclone公司，人重組表皮生長因子、人重組堿性成纖維細胞生長因子、人白血病抑制因子購自美國Chemicon公司；B27購自美國Life Technologies公司；TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本Takara公司；MKP-1及內(nèi)參GAPDH引物設計和合成均由上海吉瑪科技生物有限公司完成；MTT、CCK-8、BCA試劑盒均購自日本Takara公司，CD133/2-PE購自美國Miltenyi Biotech公司；抗Sry相關(guān)HMG-box基因家族B亞型（Sry-related HMG box2，SOX2）、抗-SOX9、p38、JNK、ERK1/2抗體及內(nèi)參GAPDH購自美國Santa公司；酶標儀、分光光度計和PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 腦膠質(zhì)瘤干細胞的分離和培養(yǎng)

根據(jù)參考文獻［9］對腦膠質(zhì)瘤組織進行機械破碎，獲得惡性膠質(zhì)瘤細胞，以2%的胎牛血清在培養(yǎng)基中預培養(yǎng)1周，然后在含10%胎牛血清和抗生素的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過形態(tài)學觀察和抗-GFAP單克隆抗體染色確定其膠質(zhì)源性。將惡性膠質(zhì)瘤細胞分散成單個并用含0.5%牛血清白蛋白和2 mmol/L乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖溶液重懸，以微磁珠進行磁性標記，然后以磁細胞分離柱分離陽性磁細胞，CD133/2-PE染色后進行流式分析確認。篩選出的CD133+細胞即為GSC，以含有濃度均為20μg/L的人重組表皮生長因子、人重組堿性成纖維細胞生長因子、人白血病抑制因子和2% B27的DMEMF12培養(yǎng)基培養(yǎng)，維持原發(fā)性腫瘤分子特征。

1.4 構(gòu)建MKP-1過表達腦膠質(zhì)瘤干細胞模型

轉(zhuǎn)染前1 d，將膠質(zhì)瘤干細胞用不含抗生素的培養(yǎng)基以1.0×105/孔的密度鋪板。細胞用含濃度均為20μg/L的人重組表皮生長因子、人重組堿性成纖維細胞生長因子、人白血病抑制因子和2% B27的DMEMF12培養(yǎng)基培養(yǎng)，當細胞匯合度達70%～90%時，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，實驗分為3組：MKP-1組轉(zhuǎn)染MKP-1過表達質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，空白組僅加入等體積的含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液。各組轉(zhuǎn)染6 h后更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后驗證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后48 h進行RT-PCR檢測，轉(zhuǎn)染后72 h進行Western blot實驗。

1.5 MTT實驗檢測HDACi MS-275半數(shù)抑制濃度

取對數(shù)生長期的MKP-1組、對照組、空白組腦膠質(zhì)瘤干細胞，以5 000/孔的密度接種于96孔板，每組6個復孔，同時設無細胞的空白對照組，以梯度濃度的HDACi MS-275處理，藥物終濃度依次為1.0 nmol/mL、2.0 nmol/mL、5.0 nmol/mL、10.0 nmol/mL、20.0 nmol/mL、40.0 nmol/mL、80.0 nmol/mL、160.0 nmol/mL。48 h后，每孔加入5μg/mL MTT溶液20μL，孵育4 h后棄上清液，加入DMSO 200μL/孔，振蕩10 min，酶標儀讀取吸光度A490值，計算HDACi MS-275的IC50值。實驗重復3次。

1.6 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期的MKP-1組、對照組、空白組腦膠質(zhì)瘤干細胞，制成細胞懸液并計數(shù)，以4 000/孔的密度接種于96孔板。將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后每孔加入CCK-8溶液10μL，繼續(xù)孵育1～4 h。采用酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度（A）值。根據(jù)吸光度值計算3組細胞增殖能力，實驗重復3次。在檢測HDACi對細胞增殖影響的實驗中分為HDACi組和對照組，HDACi組中各孔加入含1/2 IC50HDACi MS-275培養(yǎng)液100μL，對照組加入等體積培養(yǎng)液，其余步驟同上。

1.7 RT-PCR檢測MKP-1、SOX2及SOX9 mRNA的表達情況

用Trizol法提取待測細胞總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行RT-PCR。PCR體系（20μL）：待測cDNA 2μL，上游引物、下游引物各0.8μL，ROX 0.4μL，TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，ddH2O 6μL；反應條件：95℃30 s，95℃5 s、60℃34 s 40個循環(huán)。以ABI 7500實時定量PCR系統(tǒng)進行實驗，引物序列見表1。收集熒光信號，并建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，以2-△△Ct法分析，進行半定量比較。以GAPDH為內(nèi)參。實驗重復3次。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.8 Western blot實驗檢測SOX2、SOX9、p38、JNK及ERK1/2蛋白表達情況

提取各組細胞總蛋白，以BCA試劑盒測定蛋白濃度。將各組蛋白與Loading buffer充分混合后于100℃煮沸5 min變性，每孔50μL并加入SDS-PAGE凝膠上樣孔進行電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉。加入按使用說明稀釋后的待測一抗（目的蛋白SOX2、SOX9、p38、JNK，稀釋比例均為1∶1 000，ERK1/2稀釋比例為1∶2 000），4℃孵育過夜。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（稀釋比例1∶5 000）。37℃孵育1 h，TBST清洗后以ECL發(fā)光液顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參，分析各蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學意義，進一步的兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MKP-1在腦膠質(zhì)瘤組織和健康腦組織中的表達

RT-PCR實驗顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中MKP-1的表達水平較對照健康腦組織明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（0.31±0.06 vs 1.00±0.10，P＜0.001），見圖1。

圖1 MKP-1在腦膠質(zhì)瘤組織及健康腦組織中的表達Fig.1 Expression of MKP-1 in glioma tissues and healthy brain tissues

2.2 過表達MKP-1腦膠質(zhì)瘤干細胞構(gòu)建及對細胞增殖能力的影響

以MKP-1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤干細胞后，RT-PCR實驗結(jié)果顯示，MKP-1組中MKP-1表達較對照組和空白組明顯升高（2.46±0.43 vs 0.99±0.10 &1.01±0.10，P＜0.001），對照組和空白組MKP-1表達量差異無統(tǒng)計學意義（0.99±0.10 vs 1.01±0.10，P=0.990），見圖2A。CCK-8實驗結(jié)果顯示，MKP-1組膠質(zhì)瘤干細胞增殖能力較對照組和空白組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（0.64±0.06 vs 1.01±0.10 & 0.99±0.11，P＜0.001），見圖2B。

圖2 轉(zhuǎn)染后腦膠質(zhì)瘤干細胞中MKP-1的表達及細胞增殖能力Fig.2 Expression of MKP-1 in GSC and cell proliferation ability after transfection

2.3 MKP-1對HDACi作用腦膠質(zhì)瘤干細胞的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，HDACi MS-275處理腦膠質(zhì)瘤干細胞的IC50為（55.12±7.31）nmol/mL。HDACi處理后，CCK-8實驗顯示，HDACi組腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖能力較對照組明顯降低（0.63±0.05 vs 1.01±0.10，P＜0.001），見圖3A。RT-PCR結(jié)果顯示，HDACi組MKP-1表達較對照組明顯增加（2.01±0.23 vs 0.99±0.08，P＜0.001），見圖3B。HDACi MS-275處理過表達MKP-1膠質(zhì)瘤干細胞的IC50明顯較空白組和對照組降低［（33.12±6.12）nmol/mL vs 53.13±5.36）nmol/mL &（55.12±7.31）nmol/mL，P＜0.001］，見圖3C。

圖3 MKP-1對HDACi作用腦膠質(zhì)瘤干細胞的影響Fig.3 Effect of MKP-1 on glioma stem cells treated by HDACi

2.4 MKP-1過表達對SOX2和SOX9表達的影響

RT-PCR及Western blot實驗結(jié)果顯示，MKP-1組腦膠質(zhì)瘤干細胞中干細胞相關(guān)因子SOX2、SOX9 mRNA和蛋白表達較對照組和空白組明顯降低（0.61±0.05 vs 1.01±0.11 & 0.99±0.09，P＜0.05；0.53±0.09 vs 0.98±0.09 &1.01±0.11，P＜0.005），見圖4。

圖4 MKP-1過表達對腦膠質(zhì)瘤干細胞中SOX2和SOX9表達的影響Fig.4 Effect of MKP-1 overexpression on SOX2 and SOX9 in glioma stem cells

2.5 MKP-1過表達對p38、JNK和ERK1/2表達的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，MKP-1組腦膠質(zhì)瘤干細胞中JNK和p38的表達較對照組和空白組明顯降低（P＜0.001），而ERK1/2在3組中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 MKP-1過表達對腦膠質(zhì)瘤干細胞中p38、JNK和ERK1/2表達的影響Fig.5 Effect of MKP-1 overexpression on p38，JNK and ERK1/2 in glioma stem cells

3 討論

MKP-1在各種腫瘤細胞中普遍表達，其轉(zhuǎn)錄隨著生長因子、氧化應激、細胞因子、缺氧以及DNA損傷而迅速增加［10］。目前研究認為MKP-1與腫瘤發(fā)生有關(guān)，但在各類腫瘤中的作用不一。有研究報道MKP-1過表達可促進前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌和肺癌發(fā)生［11-14］。MKP-1通過誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和蛋白酶C途徑可促進乳腺癌進展，還可調(diào)控ERK活性而影響肝細胞癌進展［15］。其中在肝細胞癌和頭頸部腫瘤的發(fā)生中MKP-1主要發(fā)揮抑制作用［16］。本研究亦發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤組織中MKP-1表達明顯較健康腦組織降低，說明MKP-1與膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)。

HDACi是一組表觀遺傳分子，其中Bellinostat已獲FDA批準用于治療皮膚T細胞淋巴瘤。HDACi在膠質(zhì)瘤，特別是膠質(zhì)母細胞瘤的臨床前和臨床試驗中展現(xiàn)出良好的應用前景［17-18］。本研究采用HDACi MS-275作用膠質(zhì)瘤干細胞后其增殖能力明顯降低，且MKP-1表達明顯上調(diào)，在構(gòu)建的MKP-1過表達膠質(zhì)瘤干細胞中發(fā)現(xiàn)HDACi的殺傷效果在MKP-1過表達的膠質(zhì)瘤干細胞中更明顯。GIL-ARAUJO等［15］采用HDACi SAHA處理腦膠質(zhì)瘤細胞時，亦發(fā)現(xiàn)MKP-1表達升高2～15倍。提示MKP-1有望成為監(jiān)測腦膠質(zhì)瘤對HDACi敏感性的生物標志物。

MKP-1具有核定位，其主要底物是氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2），但對這些底物的偏好取決于組織或特定細胞類型［5-6］。MKP-1可使p38和JNK通路激酶去磷酸化而失活。本研究發(fā)現(xiàn)MKP-1在GSC中過表達可降低其增殖能力，抑制腫瘤干細胞相關(guān)因子SOX2、SOX9的表達，從而導致GSC的自我更新能力降低，這可能是MKP-1過表達抑制膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的機制之一。MKP-1的活性與GSC維持呈負相關(guān)，MKP-1可能調(diào)節(jié)GSC增殖、自我更新和分化之間的相互作用，除SOX因子外，這些活動極可能由JNK激酶介導。本研究進一步檢測過表達MKP-1 GSC中p38和JNK的表達情況，發(fā)現(xiàn)高水平的MKP-1可下調(diào)p38和JNK表達。JNK活性增加是GSC誘導腫瘤啟動的動力，同樣JNK途徑的激活可使GSC維持在未成熟階段并促進放射治療抗性［19-21］。因此HDACi的殺傷效果在MKP-1過表達的GSC中更明顯可能通過下調(diào)p38和JNK表達實現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HDACi MS-275對GSC細胞亞群具有確切的殺傷效果，MKP-1過表達時HDACi殺傷作用更明顯，這可能通過降低干細胞標志物SOX2、SOX9表達，減少GSC的自我更新實現(xiàn)。此外，MKP-1還可降低GSC中p38和JNK的活化，這可能是其抑制GSC維持和誘導腫瘤啟動能力的機制之一。后續(xù)將進一步通過動物實驗分析HDACi及MKP-1表達對GSC成瘤能力的影響，探索HDACi殺傷腦膠質(zhì)瘤干細胞的分子機制及MKP-1在其中的作用。