蔣耀瑛 霍湘蕓 董子鈺

摘要：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化紅葉石楠綠葉中類胡蘿卜素的提取工藝條件，并用柱層析分離純化粗提液中的類胡蘿卜素。結(jié)果表明，在40 ℃下以丙酮∶乙醇= 1∶1為提取劑，料液比1∶10，浸提時(shí)間1.5 h，類胡蘿卜素含量可達(dá)51.26 μg/g。該類胡蘿卜素粗提液經(jīng)過(guò)柱層析法初步分離純化，純化倍數(shù)可達(dá)1.41。

關(guān)鍵詞：紅葉石楠;類胡蘿卜素;提取;純化;柱層析

中圖分類號(hào)：TS201.2 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.009

Abstract：On the basis of single factor experiment，orthogonal experiment was used to optimize the extraction conditions of carotenoids from Photinia fraseri，and then the carotenoids in the crude extract were separated and purified by column chromatography. The results showed that the extraction rate of carotenoids could reach the maximum of 51.26 μg/g when acetone∶ethanol=1∶1 was used as extractant at 40 ℃，and the ratio of material to liquid was 1∶10 for 1.5 h. In addition，the preliminary exploration of purification and separation of carotenoid crude extract was also carried out. The purification multiple can reach 1.41.

Key words：Photinia fraseri;carotenoids;extraction;purification;column chromatography

類胡蘿卜素是所有光合生物及一些非光合原核生物與真菌合成的親脂性天然色素，對(duì)植物、動(dòng)物和人都具有廣泛的生物學(xué)作用[1]。有些類胡蘿卜素可以作為維生素A的前體來(lái)改善視力，還有清除自由基、延緩衰老、增強(qiáng)免疫功能等多種功效。另外，也可以作為食品、化妝品的天然著色劑。隨著對(duì)類胡蘿卜素需求的日益增加，綜合開(kāi)發(fā)利用植物類胡蘿卜素已成為迫切需求。據(jù)報(bào)道，已有研究從作為觀賞植物的紅葉石楠葉中提取出了黃酮類化合物、綠色素類[2]、熊果酸[3]、齊墩果酸[4]，但還鮮有提取類胡蘿卜素的報(bào)道。對(duì)紅葉石楠綠葉中類胡蘿卜素的提取及分離純化工藝進(jìn)行初步研究，以期為紅葉石楠綠葉中類胡蘿卜素的有效開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料與儀器

石楠葉，新鮮紅葉石楠綠葉片，2018年4月采摘于中國(guó)藥科大學(xué)江寧校區(qū)食堂門口。選擇顏色明艷、大小均勻、形狀完整的葉片，洗凈瀝干水分后，于烘箱內(nèi)40 ℃下烘干，恒質(zhì)量后真空干燥1 h，然后粉碎、過(guò)100目篩，避光保存。

主要試劑：丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、無(wú)水乙醇、β-胡蘿卜素、氧化鋁、硅藻土等，均為分析純?cè)噭?柱層析硅膠，100～200目。

主要儀器：DFY-500型高速中藥粉碎機(jī)、DZF- 6050型真空干燥箱、TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋、TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)等。

1.2 ? 類胡蘿卜素的提取

準(zhǔn)確稱取1 g紅葉石楠綠葉粉末，以一定料液比加入提取溶劑，在一定溫度下提取一定時(shí)間，離心得上層清液即為粗提液。

（1）料液比的影響。丙酮為溶劑，分別稱取1.0 g粉末于試管中，溫度40 ℃，料液比1∶10，1∶15， 1∶20，1∶25，1∶30條件下暗處水浴密封提取2 h。于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

（2）提取時(shí)間的影響。以丙酮為溶劑，分別稱取1.0 g粉末于試管中，提取溫度40 ℃，料液比 1∶20，暗處水浴密封提取1.0，1.5，2.0，2.5 h。于波長(zhǎng) 450 nm處測(cè)定吸光度。

（3）提取溶劑的影響。選用無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮∶石油醚（1∶2），丙酮∶石油醚（3∶7），丙酮∶乙醇（1∶1）為溶劑，分別稱取1.0 g粉末于試管中，料液比 1∶20，溫度40 ℃，暗處水浴密封提取2 h。于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

（4）提取溫度的影響。丙酮為溶劑，分別稱取1.0 g粉末于試管中，料液比 1∶20，分別在溫度30，35，40，45，50 ℃下暗處水浴密封提取2 h。于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

（5）正交試驗(yàn)。紅葉石楠葉類胡蘿卜素分離的正交試驗(yàn)采用四因素三水平L9（34）的設(shè)計(jì)方法。

提取正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3 ? 類胡蘿卜素的分離純化

選用一定的吸附劑和洗脫劑濕法裝柱，加入 ? ? 1 mL類胡蘿卜素粗提液，用一定洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集色素液，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

（1）吸附劑的選擇。分別稱取15 g硅膠、硅藻土、氧化鋁、硅膠∶硅藻土= 1∶1吸附劑，濕法裝柱，加入1 mL類胡蘿卜素粗提液，用洗脫劑（石油醚∶丙酮= 2∶1）進(jìn)行洗脫，收集色素液，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

（2）吸附劑質(zhì)量的選擇。分別稱取10.0，15.0， 17.5，20.0，25.0 g的硅膠，用洗脫劑（石油醚∶丙酮= 2∶1）濕法裝柱，進(jìn)行洗脫，收集色素液，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

（3）洗脫劑的選擇。稱取5份15 g硅膠，分別用洗脫劑（石油醚∶丙酮= 4∶1，10∶3，7∶3，2∶ 1，5∶3）濕法裝柱，加入1 mL類胡蘿卜素粗提液，洗脫，收集色素液，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

1.4 ? 類胡蘿卜素含量的測(cè)定

于波長(zhǎng)450 nm下測(cè)粗提液的吸光度，根據(jù)β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算類胡蘿卜素含量。

Y=0.073 6X+0.002 7，Y為吸光度，X為質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.5 ? 類胡蘿卜素的定性分析

采用1.3中最佳純化條件下的分離色素液，用純丙酮作對(duì)照，于波長(zhǎng)300～700 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描分析。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 紅葉石楠類胡蘿卜素的提取

料液比對(duì)紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見(jiàn)圖1，提取時(shí)間對(duì)紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見(jiàn)圖2，提取溶劑對(duì)紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見(jiàn)圖3，提取溫度對(duì)紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見(jiàn)圖4。

從圖1可知，在料液比1∶10時(shí)，類胡蘿卜素總含量最高，提取效果最好。由圖2可知，隨著提取時(shí)間增加，類胡蘿卜素含量提高，超過(guò)2 h后，類胡蘿卜素含量逐漸減少。由圖3可知，最佳提取溶劑為丙酮，此時(shí)類胡蘿卜素含量達(dá)最大值，類胡蘿卜素提取效果最佳。由圖4可知，提取溫度在40 ℃時(shí)，類胡蘿卜素總含量最高，提取效果最好。

L9（34）提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，各因素影響大小依次為料液比>提取溫度>提取時(shí)間>提取溶劑，最優(yōu)理論條件組合是A1B3C2D2，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，此結(jié)果提取效果最佳，類胡蘿卜素含量平均值為51.40 μg/g，但跟表2中最高提取組合A1B2C2D2中類胡蘿卜素含量51.26 μg/g差距不大，考慮到經(jīng)濟(jì)效益，因此選擇在40 ℃下以丙酮∶乙醇= 1∶1為提取劑，料液比1∶10，浸提時(shí)間1.5 h為最佳提取方案。

2.2 ? 紅葉石楠類胡蘿卜素的分離純化

吸附劑種類對(duì)類胡蘿卜素含量的影響見(jiàn)圖5，吸附劑質(zhì)量對(duì)類胡蘿卜素含量的影響見(jiàn)圖6，洗脫劑種類對(duì)類胡蘿卜素含量的影響見(jiàn)圖7。

由圖5可知，當(dāng)吸附劑為硅膠時(shí)，類胡蘿卜素含量達(dá)到最大值，分離純化效果最佳。由圖6可知，吸附劑硅膠質(zhì)量為20 g時(shí)，分離純化效果最好。由圖7可知，當(dāng)洗脫劑為石油醚∶丙酮= 10∶3時(shí)，分離純化效果最好。

由于硅膠外的其他吸附劑分離純化效果不佳，因此不再進(jìn)行正交試驗(yàn)獲取最佳純化方案，由吸附劑質(zhì)量及洗脫劑種類試驗(yàn)，純化倍數(shù)最高的方案是20 g硅膠作為吸附劑，石油醚∶丙酮= 2∶1作為洗脫劑，測(cè)得樣品類胡蘿卜素質(zhì)量濃度為7.22 μg/mL。此時(shí)純化倍數(shù)= 7.22/5.13 = 1.41，式中5.13和7.22分別為純化前后樣品中類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度。

2.3 ? 紅葉石楠類胡蘿卜素紫外吸收光譜圖

分離的類胡蘿卜素吸收光譜圖見(jiàn)圖8，β -胡蘿卜素吸收光譜圖見(jiàn)圖9。

由圖8可知，紅葉石楠綠葉中分離的類胡蘿卜素具有類胡蘿卜素的3個(gè)吸收峰的光譜特征，與圖9進(jìn)行對(duì)比，更能看出分離色素的最大吸收波長(zhǎng)和精細(xì)結(jié)構(gòu)與β -胡蘿卜素較吻合[5]。

3 ? 結(jié)論

從紅葉石楠綠葉中提取類胡蘿卜素的最佳工藝條件為在40 ℃下以丙酮∶乙醇= 1∶1為提取劑，料液比1∶10，浸提時(shí)間1.5 h，其類胡蘿卜素提取率平均值可達(dá)51.26 μg/g，具有一定的可行性和應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步探索研究。

參考文獻(xiàn)：

何卿，孫國(guó)峰，林秦文，等. 植物類胡蘿卜素提取與分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)，2018，53（5）：700-709.

衛(wèi)強(qiáng)，張國(guó)升，劉金旗，等. 石楠葉紅、綠色素成分比較及抗氧化活性研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2014，26（12）：1 881-1 886.

崔俊鳳，張海霞，王春檢. HPLC法測(cè)定不同地區(qū)石楠葉中熊果酸的含量[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（4）：350-352.

羅曉清，?，|，錢蘇生. RP-HPLC法測(cè)定石楠葉中熊果酸和齊墩果酸的含量[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003， 17（5）：14-15.

儲(chǔ)大燕. 煙草中類胡蘿卜素及其異構(gòu)體的分析研究[D]. 合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2009. ◇