徐日升 崔建軍 王曉梁 徐聰 黃博文 翁曼欣 謝恩義

摘 要：為探索礁膜（Monostroma nitidium）配子體生長的適宜氮、磷濃度需求，以NaNO3為氮源、KH2PO4為磷源，在不同氮（0、10、20、40、60、80 μmol/L）、磷（0.5、1、2 μmol/L）濃度梯度下，室內(nèi)培養(yǎng)礁膜配子體7 d，測定各處理組藻體的生長率、光合色素（葉綠素a、b和類胡蘿卜素）和可溶性糖。結(jié)果表明，藻體生長最適氮、磷濃度比值為20∶1;且氮濃度為20 μmol/L、磷濃度為1 μmol/L時，礁膜配子體生長率取得最大值（13.80 %/d）;氮濃度為20 μmol/L 、磷濃度為2 μmol/L時，藻體光合色素含量最高（分別為0.320 7 mg/g、0.170 8 mg/g和0.103 6 mg/g）;氮濃度為0 μmol/L 、磷濃度為2 μmol/L時，藻體可溶性糖含量最高（19.03 mg/mL）。

關鍵詞：礁膜（Monostroma nitidium）;氮磷濃度;生長率;光合色素;可溶性糖

中圖分類號：S954.4

礁膜（Monostroma nitidium）又稱綠紫菜，屬綠藻門、石莼目、礁膜科、礁膜屬，配子體是單層細胞組成的膜狀體[1]。礁膜屬海藻食用價值高，營養(yǎng)豐富且口感極佳，同時具有藥用價值，其硫酸多糖有降血脂、抗氧化以及抗炎等生物活性[25]，礁膜具有產(chǎn)業(yè)化的栽培前景[6]。國內(nèi)有關報道礁膜栽培和生長生態(tài)因子的文獻較少，陳昌生[78]側(cè)重于鹽度與營養(yǎng)鹽對配子體快速成熟形成配子囊的影響;以及光照強度對合子生長發(fā)育的研究;而礁膜配子體生長適宜的氮、磷營養(yǎng)鹽需求未見報道，本文以NaNO3和 KH2PO4作為氮、磷來源， 設計不同添加氮、磷濃度梯度下的礁膜配子體培養(yǎng)實驗， 觀察其生長情況，旨在探明其礁膜配子體生長的最適氮、磷濃度及比例，為礁膜人工產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的營養(yǎng)鹽調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 礁膜藻種

礁膜配子體2019年4月份采自廣東湛江硇洲島附近海域的高潮帶（E110°36.0923'N20°56.8266'），藻體加冰低溫運回實驗室，先用消毒海水（經(jīng)高壓滅菌30 min，冷卻至常溫）清洗去除藻體表面的泥沙和雜藻，然后在消毒海水中暫養(yǎng)7 d，條件為：溫度15 ℃;光照2 000 lx;鹽度26‰;pH 8.2;光暗比為12 h∶12 h。

1.2 試驗設計

挑選預培養(yǎng)后形態(tài)完好、顏色鮮綠的礁膜藻體0.2 g（鮮重）培養(yǎng)于250 mL錐形瓶中，置于智能型光照培養(yǎng)箱（GXZ-300D）中培養(yǎng)。試驗條件[9]：溫度15 ℃;光照4 000 lx;鹽度30‰;pH 8.2;光暗比12 h∶12 h。以NaNO3為氮源（N）、KH2PO4為磷源（P），設置不同氮（0、10、20、40、60、80 μmol/L）、磷（0.5、1、2 μmol/L）濃度梯度進行試驗，試驗過程中每隔2 d更換一次相同氮、磷濃度的滅菌消毒人工海水（AW）[10]，每處理組均設3個重復，培養(yǎng)7 d后開始進行相關測定分析（表1）。

1.3 指標測定與方法

1.3.1 生長率 培養(yǎng)結(jié)束后，用吸水紙把藻體表面的水分吸干后稱取藻體鮮重，計算生長率[11];藻體重量的生長率的計算公式如下：

GR（%/d）=[（Wt/W0）1/t -1]×100%

其中W0為初始藻的鮮重，g;Wt為培養(yǎng)結(jié)束后藻體的鮮重，g;t為培養(yǎng)周期，d。

1.3.2 光合色素含量 色素的測定按照李合生[12]《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》中的浸提法測定。先用95%乙醇提取色素，再用分光光度法測定吸光度值。以95%乙醇為空白對照，分別于波長665 nm、649 nm和470 nm處測定吸光度（A），計算公式為：

葉綠素a含量=（13.95A665-6.88A649） V/M/1 000

葉綠素b含量=（24.96A649-7.32A665） V/M/1 000

類胡蘿卜素含量=（4.08A470-11.56A649+3.29A665）V/M/1 000

式中： A為吸光度值;V為待取液體積mL;M為樣品質(zhì)量，g;各色素含量以mg/g 為單位。

1.3.3 可溶性糖 以葡萄糖作為標準品制作標準曲線，采用苯酚硫酸法進行測定[13]。

1.3.4 統(tǒng)計分析 用SPSS19.0分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標準誤差表示，并作方差分析和Duncan多重比較，P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度氮、磷對礁膜配子體生長率的影響

礁膜配子體在不同NaNO3濃度（0、10、20、40、60、80 μmol/L）、KH2PO4濃度（0.5、1、2 μmol/L）下培養(yǎng)7 d的生長率見圖1，如圖所示，在NaNO3濃度為 0～80 μmol/L時， 藻體的生長率均隨氮濃度的增加而呈先上升后下降的趨勢;當N/P為20∶1，即KH2PO4濃度在0.5、1、2 μmol/L條件下，藻體分別在NaNO3濃度為10、20、40 μmol/L時，最大生長率分別為8.7±0.6、13.8±0.8、（11.1±1.5）%/d（P<0.05）;而后隨氮濃度的進一步增加呈降低趨勢。

2.2 不同濃度氮、磷對礁膜配子體光合色素含量的影響

表2顯示的是礁膜配子體在不同氮、磷濃度下培養(yǎng)7 d后的光合色素含量，包括葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素。由表2可得，在磷濃度為0.5、1、2 μmol/L條件下，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素三個色素隨氮濃度的增加而均呈先上升后下降的趨勢，與生長率呈正相關性。對磷濃度為0.5 μmol/L處理組而言，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均在氮濃度為10 μmol/L時達到最大值，顯著高于氮濃度為0 μmol/L組（P<0.05），葉綠素a含量在10～80 μmol/L組之間差異不顯著（P>0.05）;而葉綠素b含量在10～60 μmol/L組之間差異不顯著（P>0.05），80 μmol/L組含量最低，顯著低于10、20、60 μmol/L組（P>0.05），但與0 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05）;類胡蘿卜素含量10～40 μmol/L組顯著高于0 μmol/L組（P<0.05），40、60、80 μmol/L類胡蘿卜素顯著低于10 μmol/L處理組（P<0.05），而60、80 μmol/L則與0 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05）。對磷濃度為1 μmol/L處理組而言，葉綠素a和葉綠素b含量均在20 μmol/L組達到最大值，而類胡蘿卜素含量則在0 μmol/L組最高，但與20 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05），葉綠素a在0和20 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05），而葉綠素b的20 μmol/L組顯著大于0 μmol/L組（P<0.05）;葉綠素a含量在0、10、20、40、80 μmol/L組之間無顯著性差異（P>0.05），60 μmol/L組含量最低，顯著低于20 μmol/L組（P<0.05），但與0 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05）;葉綠素b含量各處理組均顯著低于20 μmol/L組（P<0.05），各組之間無顯著性差異（P>0.05）;類胡蘿卜素含量在60 μmol/L組最低，顯著低于0、10、20 μmol/L組（P<0.05），而除60 μmol/L組外，其余各組之間無顯著性差異（P>0.05）。對磷濃度為2 μmol/L處理組而言，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均在氮濃度為20～40 μmol/L時達到最大值，顯著高于氮濃度為0 μmol/L組（P<0.05），隨后呈現(xiàn)下降趨勢，80 μmol/L組含量最低，顯著低于10～60 μmol/L組（P<0.05），與0 μmol/L組無顯著性差異（P>0.05）。

2.3 不同濃度氮、磷對礁膜配子體可溶性糖含量的影響

礁膜配子體在不同NaNO3濃度（0、10、20、40、60、80 μmol/L）、KH2PO4濃度（0.5、1、2 μmol/L）下培養(yǎng)7 d的可溶性糖含量見圖2，如圖所示，在磷濃度為0.5、1、2 μmol/L條件下，總體上看，藻體可溶性糖含量隨氮濃度的增加而均呈先下降后上升的趨勢，與生長率呈負相關性。對磷濃度為0.5 μmol/L而言，氮濃度為80 μmol/L時，藻體的可溶性糖含量最高，達到（16.19±0.82）mg/mL，顯著高于0 μmol/L處理組（P<0.05）;氮濃度為10 μmol/L時，藻體的可溶性糖含量最低，只有（10.69±0.57）mg/mL，顯著低于0 μmol/L處理組（P<0.05）。對磷濃度為1 μmol/L而言，氮濃度為10 μmol/L時，藻體的可溶性糖含量最高，達到（10.90±1.19）mg/mL，顯著高于0 μmol/L處理組（P<0.05）;氮濃度為20 μmol/L時，藻體的可溶性糖含量最低，只有（6.93±0.34）mg/mL，但與0 μmol/L處理組無顯著性差異（P>0.05）。對磷濃度為2 μmol/L而言，氮濃度為0 μmol/L時，藻體的可溶性糖含量最高，達到（19.03±0.29）mg/mL，顯著高于其余處理組（P<0.05）;氮濃度為40 μmol/L時，藻體的可溶性糖含量最低，只有（7.44±1.50）mg/mL，顯著低于其余各處理組。

3 討論

3.1 不同濃度氮、磷對礁膜配子體生長率與光合色素的影響

氮和磷是藻類生長所必需的主要元素， N、P等營養(yǎng)元素的添加，對植物的生長有較大促進作用[14-15]。

本研究結(jié)果表明， 在三種不同KH2PO4（0.5、1、2 μmol/L）水平下，不同摩爾質(zhì)量濃度的NaNO3對礁膜的生長有顯著影響 （P<0.05），總體呈現(xiàn)出藻體的生長率隨氮濃度的增加而都呈先上升后下降的趨勢，這與眾多有關研究結(jié)果相符[16-18]。藻體生長率呈現(xiàn)先升后降的原因可能是對氮、磷比例存在一個飽和點，達到飽和點時生長速率大，此處為拐點，隨后氮、磷比例增加，藻體生長會受到抑制而呈現(xiàn)生長速率下降的趨勢。同時，許多研究表明， 不同N/P對藻類的生長有顯著影響，丁剛[18]等人指出N/P為20∶1，鼠尾藻幼苗特定生長率最高，而李慧等[19]人發(fā)現(xiàn)銅藻幼苗的特定生長率在N/P為10∶1時達到最大，還有楊彬[20]等人表明莫氏馬尾藻幼苗的適宜N/P為15∶1，蔡煜[21]等人則發(fā)現(xiàn)氮、磷比為8∶1 和 10∶1 時，長莖葡萄蕨藻的特定生長率升高，本研究中礁膜配子體則在N/P為20∶1時達到最大生長率，說明礁膜配子體的生長也有特定的最優(yōu)氮、磷比濃度需求。

光合色素是反映藻類生長和光合作用的重要指標。關于氮、磷濃度對光合色素的研究中，李文慧[22]等人發(fā)現(xiàn)緣管滸苔的葉綠素和類胡蘿卜素的含量是隨著實驗中氮的濃度升高而升高的，徐智廣[23]指出氮的加富可以提高龍須菜的色素含量。而徐永健[24]則認為葉綠素a與實驗的氮的濃度關系不密切。本實驗中，在三種固定的磷濃度（0.5、1、2 μmol/L），礁膜配子體的光合色素，包括葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素總體上都是隨著氮濃度的升高而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與其生長率正相關，而且色素之間也有一定的正相關性。在磷濃度為0.5和1 μmol/L時，藻體的葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素都是在N/P為20∶1時達到最大值;而磷濃度為2 μmol/L則是在氮濃度為20 μmol/L光合色素達到最大值，與氮濃度為40 μmol/L時的光合色素沒有顯著性差異（P>0.05），此時N/P為20∶1。也就是說磷濃度為0.5 μmol/L，藻體的光合色素在氮濃度為0～10 μmol/L呈現(xiàn)上升趨勢;磷濃度為1 μmol/L，藻體的光合色素在氮濃度為0～20 μmol/L呈現(xiàn)上升趨勢;磷濃度為2 μmol/L，藻體的光合色素在氮濃度為0～40 μmol/L呈現(xiàn)上升趨勢。在一定的氮濃度范圍內(nèi)，藻體的光合色素會隨濃度的升高而升高，這也與李文慧、徐智廣[22-23]的研究結(jié)果相符合，但是光合色素含量達到最高點之后，開始呈現(xiàn)下降趨勢。對磷濃度為0.5 μmol/L的實驗組而言，藻體的葉綠素a含量在氮濃度為10～80 μmol/L并無顯著性差異（P>0.05）;葉綠素b含量在氮濃度為10～60 μmol/L并無顯著性差異（P>0.05），原因可能是氮作為合成葉綠素的原料之一必須跟磷一起吸收才能發(fā)揮作用，而在氮濃度的不斷上升的時候，磷已經(jīng)缺乏，磷就成了限制因子，所以不能促進葉綠素的合成與積累。而在10～40 μmol/L時，類胡蘿卜素含量都顯著高于0 μmol/L組（P<0.05），說明此時氮濃度范圍適宜類胡蘿卜素的積累;60～80 μmol/L類胡蘿卜素顯著低于10～20 μmol/L處理組（P<0.05），說明氮濃度過高也開始對類胡蘿卜素的積累產(chǎn)生不利影響，但并沒有抑制作用，因為60、80 μmol/L組與0 μmol/L組沒有顯著性差異（P>0.05）。對磷濃度為1 μmol/L的實驗組而言，葉綠素a含量雖然是氮濃度為20 μmol/L組達到最大值，但是總體來說變化不大，只有氮濃度為60 μmol/L組顯著低于20 μmol/L組（P<0.05），說明此氮濃度開始對葉綠素a的合成產(chǎn)生不利影響，而0、10、20、40和80 μmol/L組均無顯著性差異（P>0.05），這與徐永健[24]的結(jié)果相似，認為葉綠素a與氮的濃度關系不密切。該組的類胡蘿卜素含量與葉綠素a含量正相關性，除了60 μmol/L組顯著低于0～20 μmol/L組（P<0.05），其余各組無顯著性差異（P>0.05）。而葉綠素b含量20 μmol/L組顯著高于其余各組（P<0.05），而其余各組均無顯著性差異（P>0.05）。說明在該磷濃度下，葉綠素b對氮濃度變化并不敏感，且在20 μmol/L時含量最高，且顯著高于其他組，且該濃度下藻體的相對生長率也是最好的。對于磷濃度為2 μmol/L組而言，葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素呈正相關性，且三種色素含量也與藻體的相對生長率有正相關性關系，與生長率一樣都是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。20、40 μmol/L組，藻體的三種色素含量顯著大于其余各組（P<0.05），而其生長率則是在40 μmol/L時最大，這有很大的相關性體現(xiàn)。這與李信書[25]等人對條斑紫菜的研究發(fā)現(xiàn)各種光合色素含量存在一定的相關關系，與本文研究相似。

總體來說，在三種不同KH2PO4水平下光合色素隨氮濃度的變化規(guī)律跟生長率的趨勢相符，且三種色素之間也存在一定的正相關性。

3.3 不同摩爾質(zhì)量濃度NaNO3對礁膜配子體可溶性糖含量的影響

有研究表明[26]，可溶性糖是植物適應環(huán)境的信號物質(zhì)，對植物的生長與發(fā)育有調(diào)控作用。

有學者認為[27]，藻體過量的糖會對藻類的生長造成不利的影響。本實驗中，總體上礁膜體內(nèi)的可溶性糖含量變化趨勢與生長呈負相關。本研究中發(fā)現(xiàn)，在KH2PO4濃度為0.5 μmol/L下，NaNO3濃度為80 μmol/L時， 藻體的可溶性糖含量最高，顯著高于0 μmol/L處理組（P<0.05），而此時的生長率反而是最小的;10 μmol/L處理組，可溶性糖含量最低，顯著低于0 μmol/L處理（P<0.05），而此時的生長率最大。KH2PO4濃度為1 μmol/L下， 在NaNO3濃度為20 μmol/L時， 藻體的可溶性糖含量最低，而此時的生長率也為最高，在KH2PO4濃度為2 μmol/L下，NaNO3濃度為40 μmol/L時， 藻體的可溶性糖含量最低，而此時的生長率也是最高的。

而劉婷[28]等人則認為可溶性糖的含量會隨著氮濃度的升高而降低。本實驗中，在三種固定的磷濃度下，在氮濃度不斷上升的過程中，可溶性糖會呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，會出現(xiàn)一個最低點?？扇苄蕴遣粩嘞陆档阶畹忘c的過程與劉婷的研究結(jié)果相符，原因可能是，在這個階段藻體需要吸收氮用于合成葉綠素和蛋白質(zhì)，而可溶性糖的合成就較少，而當生長達到飽和之后，培養(yǎng)液的氮過剩，葉綠素和蛋白質(zhì)的合成就減緩，而可溶性糖的含量就開始上升不斷積累胞內(nèi)物質(zhì)，以抵抗以后氮缺乏的階段。

4 小結(jié)

藻體的生長率隨氮濃度的增加而都呈先上升后下降的趨勢，本研究中，當N/P為20∶1即KH2PO4濃度在0.5、1、2 μmol/L條件下，藻體分別在NaNO3濃度為10、20、40 μmol/L時具有最大生長率，分別為8.68±0.62、13.80±0.84、（11.10±1.50）%/d（P<0.05），光合色素含量與生長趨勢相符，也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在N/P為20∶1色素含量最高，而此時可溶性糖含量最低。

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Abstract：[Objective] To explore the appropriate nitrogen and phosphorus concentration requirements for the growth of Monostroma nitidium gametophyte.[Methods] With NaNO3 as the nitrogen source and KH2PO4 as the phosphorus source， the concentration gradients of different nitrogen （0， 10， 20， 40， 60， 80 μmol/L） and phosphorus （0.5， 1， 2 μmol/L） were set， and the M.nitidium gametophytes were cultured for 7 days in nutrient solution mentioned above， in order to determine their growth rate， photosynthetic pigments（Chla， Chlb， Carotenoides） and soluble sugar.[Results] The optimum ratio of nitrogen and phosphorus concentration for algals growth is 20∶1， and when nitrogen concentration is 20 μmol/L and phosphorus concentration is 1 μmol/L， the growth rate of the M.nitidium gametophyte reaches the maximum value （13.80 %/d）， when nitrogen concentration is 20 μmol/L and phosphorus concentration is 2 μmol/L， the photosynthetic pigments content of algal is the highest （0.320 7 mg/g， 0.170 8 mg/g and 0.103 6 mg/g， respectively）， when nitrogen concentration is 0 μmol/L and phosphorus concentration is 2 μmol/L， the content of soluble sugar was the highest （19.03 mg/mL）.[Conclusion] when N/P is 20∶1， the growth rate of M.nitidium reach the maximum value.This study provides supporting data and theoretical basis for the regulation of nutrients in cultivation of M.nitidium.

Key words：Monostroma nitidium; nitrogen and phosphorus concentration; growth rate; photosynthetic pigment; soluble sugar