駱縱縱，陶夢(mèng)婷，張瑾，周睿

(1.安徽建筑大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601)

0 引言

水體污染問題已成為亟需解決的環(huán)境問題之一[1]，而重金屬作為水體中一類典型的污染物，不僅具有毒性還具有生物累積性，故對(duì)環(huán)境生物的生存和人類健康都具有潛在風(fēng)險(xiǎn)[2]。

近年來水體中鎘(Cadmium，Cd)引起的飲用水安全問題頻頻發(fā)生[3]。云南省楚雄市的龍川江和廣東省韶關(guān)市的北江均是重要的經(jīng)濟(jì)帶和飲用水水源地，且龍川江楚雄段和北江韶關(guān)段均發(fā)生過嚴(yán)重Cd 污染事件，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩江流域斷面的總Cd含量分別超標(biāo)36.4 倍和12 多倍，致使周圍居民飲用水安全難以得到保障[4]。楊曉輝[5]等對(duì)巢湖水系進(jìn)行了Cd 污染檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)合肥市區(qū)的南淝河部分采樣點(diǎn)中Cd 的富集系數(shù)在10.0～21.0，在11 個(gè)采樣點(diǎn)中，有10 個(gè)采樣點(diǎn)的Cd 含量均值超過660 μg/kg，且有3 個(gè)采樣點(diǎn)的Cd 含量已高于1000 μg/kg，檢測(cè)數(shù)據(jù)表明該水體中Cd 污染程度非常嚴(yán)重。龍江河也曾爆發(fā)過Cd 污染事件，據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示該流域水體中Cd 濃度最高超標(biāo)已達(dá)80 倍以上[6]。因此，水體中Cd 污染現(xiàn)象已非常嚴(yán)重。

水體中的Cd 污染對(duì)自然環(huán)境和人類健康都造成了諸多危害。李海芹等[7]研究發(fā)現(xiàn)水體的重金屬污染不僅會(huì)直接對(duì)水生動(dòng)物的新陳代謝、器官發(fā)育、后代繁衍及基因穩(wěn)定產(chǎn)生嚴(yán)重影響，也會(huì)對(duì)水生植物的葉綠素含量、細(xì)胞酶的分泌、光合作用及呼吸作用造成直接的損傷，且當(dāng)水體重金屬污染嚴(yán)重時(shí)，會(huì)直接造成水生動(dòng)植物的死亡。王俊能等[8]將廣西龍江水體中的多種魚類作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)在水體中Cd 污染突發(fā)初期，魚肌肉中的Cd 含量較高，且突發(fā)點(diǎn)周圍居民食用受Cd 污染的魚類所導(dǎo)致健康危害的風(fēng)險(xiǎn)值高達(dá)9.03×10-5·a-1。吳思英等[9]對(duì)福建地區(qū)長(zhǎng)期受Cd 污染的6 個(gè)自然村中5 年人口死亡情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)匦律鷥旱乃劳雎蔬h(yuǎn)高于同縣的非污染區(qū)，且污染區(qū)居民因患有惡性腫瘤、呼吸系疾病和消化系疾病而死亡的概率也遠(yuǎn)高于非污染區(qū)。由此看來水體中的Cd污染問題十分嚴(yán)峻，并已對(duì)水環(huán)境及人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。

在目前的水體重金屬污染治理方法中，微生物治理方法具有低成本、作用面積較大、體積較小以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且相比于傳統(tǒng)治理方法，微生物凈化水體效果更加明顯，且適用于多種水體中重金屬和有毒污染物的去除[10]。黃飛[11]以篩選所得的耐Cd 蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus RC-1)作為微生物吸附劑，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌對(duì)水體中Cd2+污染的去除能達(dá)到較好的效果，且避免了二次污染的產(chǎn)生。因此，利用微生物治理水體中重金屬污染問題具有可行性。

本文將已從土壤中篩選出的一株對(duì)重金屬Cd具有耐性的粘質(zhì)沙雷氏菌(AR1 KX343948.1)作為實(shí)驗(yàn)菌株，探討在不同的藥物濃度、加菌量、菌齡、pH 值和處理時(shí)間下耐性菌對(duì)Cd 的去除效果，以明確耐性菌對(duì)Cd 的較優(yōu)去除條件。研究結(jié)果將為重金屬污染水體的治理提供數(shù)據(jù)和方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及試劑

實(shí)驗(yàn)菌種：粘質(zhì)沙雷氏菌(AR1 KX343948.1)。事先從安徽建筑大學(xué)校園林地新鮮土壤樣品中篩選所用菌株，其篩選鑒定方法見文獻(xiàn)[12]。

實(shí)驗(yàn)試劑：胰蛋白胨、牛肉膏、NaCl、CdCl2·2.5H2O、Cd 標(biāo)準(zhǔn)溶液。以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

GZ2100 高壓蒸汽滅菌鍋；SF-CT-1A 凈化工作臺(tái)；HQZ-82 恒溫?fù)u床；SHP-250FE 智能生化培養(yǎng)箱；TG16K-II 臺(tái)式高速離心機(jī)；UV-5100 紫外可見光分光光度計(jì)；SA8 振蕩器(BioCote)；Optima8000電感耦合等離子體光譜儀(PerkinElmer)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體及菌懸液的制備

挑取2～3 環(huán)菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)。24 h 后8000 r/min 離心10 min 并倒盡上清液，再用蒸餾水清洗并離心，重復(fù)兩次，得到濕潤菌體。再用移液槍吸取蒸餾水反復(fù)吹打濕菌體，并稀釋菌懸液，控制其OD600 值在0.7 左右，再將菌懸液震蕩30 s，即得菌懸液，備用。

1.2.2 Cd 的測(cè)定方法及其去除率的計(jì)算公式

(1)Cd 的測(cè)定方法

用電感耦合等離子光譜儀測(cè)定Cd 的濃度。

(2)Cd 去除率的計(jì)算公式

式中：Co 為空白組中Cd 的濃度，mg/L；Co 為實(shí)驗(yàn)組中Cd 的濃度，mg/L。

1.2.3 耐性菌對(duì)Cd 去除條件的研究

(1)藥物濃度及加菌量對(duì)耐性菌去除Cd 的影響

配置3、6、12.5 和25 mg/L 的含Cd 液體培養(yǎng)基，菌齡為4.5 h，調(diào)節(jié)pH 為7.2～7.4，將制備好的菌液以1%、2%、3%、4%和5% 的比例加入培養(yǎng)基中，每組設(shè)三個(gè)平行兩個(gè)空白，在30 ℃和150 r/min 條件下處理48 h 后取樣，離心取上清液過0.45 μm 濾膜，測(cè)定Cd 含量并計(jì)算去除率。

(2)菌齡對(duì)耐性菌去除Cd 的影響

在制備菌懸液時(shí)，選擇在處理時(shí)間為4.5、8、12和24 h 時(shí)離心制備，得到相應(yīng)菌齡的菌懸液。配置3 mg/L 的含Cd 液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 為7.2～7.4，向培養(yǎng)基中加入比例為4%的菌懸液，每組設(shè)三個(gè)平行兩個(gè)空白，在30 ℃和150 r/min 條件下處理48 h 后取樣，離心取上清液過0.45 μm 濾膜，測(cè)定Cd 含量并計(jì)算去除率。

(3)pH 對(duì)耐性菌去除Cd 的影響

配置3 mg/L 的含Cd 液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 值分別為4.5、6.0、7.4、8.0 和9.4，菌齡為4.5 h，將菌懸液按4% 的比例加入含Cd 培養(yǎng)基中，在30 ℃和150 r/min 條件下處理48 h 后取樣，離心取上清液過0.45 μm 濾膜，測(cè)定Cd 含量并計(jì)算去除率。

(4)處理時(shí)間對(duì)耐性菌去除Cd 的影響

配置一系列3 mg/L 的含Cd 液體培養(yǎng)基，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值為9.4，菌齡為4.5 h，將菌懸液按4% 的比例加入含藥培養(yǎng)基中，在30 ℃和150 r/min 條件下分別處理4、8、12、24、48 和96 h后取樣，離心取上清液過0.45 μm 濾膜，測(cè)定Cd 含量并計(jì)算去除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物濃度及加菌量對(duì)耐性菌去除Cd的影響

圖1 藥物濃度及加菌量對(duì)耐性菌去除Cd的影響

該粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)Cd 的耐受濃度能達(dá)到1000 mg/L[13]，故耐性菌在本實(shí)驗(yàn)所選Cd 濃度下均能正常存活。由圖1 可得，隨著Cd 初始濃度的增大，粘性沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除率在下降，當(dāng)Cd 為3 mg/L 去除效果最好。除藥物濃度外加菌量對(duì)耐性菌去除Cd 的效果也有影響，當(dāng)Cd 的濃度為3 mg/L 時(shí)，粘性沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除率在57%作右，且隨加菌量的增大，去除率也在增大；當(dāng)Cd的濃度為3 mg/L 且加菌量為4% 時(shí)，去除率達(dá)到峰值，峰值為69.83%。當(dāng)Cd 的濃度為6 mg/L 時(shí)，隨加菌量的增大，耐性菌對(duì)Cd 的去除不斷升高，最高時(shí)可達(dá)58.69%。當(dāng)Cd 的濃度為12.5 mg/L時(shí)，耐性菌對(duì)Cd 的最高去除率為45.87%，且加菌量的增大，會(huì)抑制耐性菌對(duì)Cd 的去除。當(dāng)Cd 的濃度為25 mg/L 時(shí)，耐性菌對(duì)Cd 的最高去除率為20.84%，且加菌量的變化對(duì)Cd 去除率的影響較小，分析其原因在于濃度相對(duì)較高時(shí)，菌株表面的吸附位點(diǎn)已達(dá)到飽和，其吸附量相比于對(duì)高濃度的溶液來說較小，故呈現(xiàn)為高濃度重金屬環(huán)境中加菌量對(duì)重金屬的去除率影響不顯著；在Cd 的濃度較低時(shí)，Cd 的去除率隨加菌量增加而增大，這說明在重金屬環(huán)境中，微生物數(shù)量的增加能提供更多的吸附位點(diǎn)，只要微生物表面吸附位點(diǎn)未達(dá)到飽和，則菌株對(duì)Cd 的去除率就會(huì)增加。鄒水林[14]研究發(fā)現(xiàn)Citrobacter sp.E 對(duì)重金屬Cu2+具有去除作用，且菌體添加量的增加，對(duì)Cu2+的去除率呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)菌體添加量為20g/L 時(shí)，Cu2+的去除率增加到最大值，此后，當(dāng)菌體添加量繼續(xù)增加時(shí)，由于結(jié)合位點(diǎn)逐漸飽和，故Cu2+的去除率有所減小。LONG 等[15]研究發(fā)現(xiàn)隨著工業(yè)廢水中鉛離子初始濃度的增大改性雙孢蘑菇菌(Agaricus bisporus)對(duì)其去除率逐漸降低。即Cd 的初始濃度和耐性菌的加菌量均會(huì)對(duì)耐性菌去除Cd 的效果產(chǎn)生一定的影響。低濃度會(huì)促進(jìn)耐性菌的生長(zhǎng)，但當(dāng)濃度過高時(shí)會(huì)抑制耐性菌的生長(zhǎng)。

2.2 菌齡對(duì)耐性菌去除Cd的影響

由圖2 可得，當(dāng)菌齡為2 h 時(shí)，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除率為33.24%，且在菌齡為2 h 到4.5 h時(shí)，耐性菌對(duì)Cd 的去除率不斷增大。當(dāng)菌齡為4.5 h 時(shí)，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除率最大，最大值為33.92%。在菌齡為4.5 h 到24 h 時(shí)，隨菌齡的增加，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除率逐漸降低。其原因在于4.5 h 時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)能力強(qiáng)于8、12 和24 h，微生物生長(zhǎng)旺盛，繁殖能力強(qiáng)，同時(shí)，菌體的活性較高，故加入含藥培養(yǎng)基之后，能快速適應(yīng)環(huán)境和繁殖，對(duì)重金屬的去除作用也較為顯著。但隨菌齡的增加，微生物的生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡，故隨著菌齡的增大，Cd 的去除率降低。已有研究表明，菌體在不同的生長(zhǎng)階段，其對(duì)重金屬的去除能力也不同，主要是因?yàn)椴煌L(zhǎng)階段的菌體細(xì)胞表明的代謝物質(zhì)含量不同，這進(jìn)一步影響了菌體與重金屬的結(jié)合能力[14]，即表明菌齡與菌的活性相關(guān)，菌齡也是對(duì)重金屬去除效果的影響因素之一。

圖2 菌齡對(duì)耐性菌去除Cd的影響

2.3 pH對(duì)耐性菌去除Cd的影響

由圖3 可得，pH 對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌去除重金屬的影響較大，根據(jù)專利文獻(xiàn)資料的實(shí)驗(yàn)過程及相關(guān)數(shù)據(jù)查證可得：耐性菌對(duì)pH 的耐受范圍是4～10[15]，故耐性菌在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的pH 條件下可以正常生存。pH 較低，即溶液呈酸性時(shí)，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除率較低，但隨著pH 的升高，去除率逐漸增高。在pH 為9.4 時(shí)，耐性菌對(duì)Cd 的去除率達(dá)到最大值，此時(shí)去除率為71.14%。沈薇等[16]在對(duì)木霉活細(xì)胞吸附Pb(Ⅱ)機(jī)理的研究中，得出細(xì)胞壁上的各種基團(tuán)的活性與pH 值緊密相關(guān)。故分析本文中pH 不同去除效果不同的原因?yàn)椋簆H 較低時(shí)，H+和H30+與重金屬離子之間可能存在競(jìng)爭(zhēng)作用位點(diǎn)的情況，從而導(dǎo)致重金屬的去除率降低，這與張丹[17]等的研究結(jié)果具有一致性。

圖3 pH對(duì)耐性菌去除Cd的影響

2.4 處理時(shí)間對(duì)耐性菌去除Cd的影響

根據(jù)該粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)周期為18 h[18]，本研究分別在處理為4、8、12、24、48 和96 h 后取樣，并分析處理時(shí)間對(duì)耐性菌去除Cd 的影響。由圖4可得，處理時(shí)間越長(zhǎng)，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除率越高。在4、8 和12 h 時(shí)，耐性菌對(duì)Cd 的去除率較低均在46% 左右；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，24、48和96 h 時(shí)去除率分別達(dá)到52.21%、71.70% 和91.00%。隨著處理時(shí)間的增加，溶液中菌株的數(shù)量同樣增加，這樣菌株為重金屬離子提供的作用位點(diǎn)也越多，微生物通過分泌胞外物質(zhì)固定重金屬，那么菌株數(shù)量的增加，雖然導(dǎo)致生長(zhǎng)存在競(jìng)爭(zhēng)，但分泌物的量保持增加，重金屬的去除率同樣提高[19]。

圖4 處理時(shí)間對(duì)耐性菌去除Cd的影響

3 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，當(dāng)Cd 濃度在3 mg/L，加菌量為培養(yǎng)液的4%，pH 為9.4，菌齡為4.5 h 及處理時(shí)間為96 h 時(shí)，粘質(zhì)沙雷氏菌(AR1 KX343948.1)對(duì)重金屬Cd 的去除效果達(dá)到最優(yōu)，且最高去除率為91.00%。粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)Cd 的去除效果在偏低濃度(3～6mg/L)條件下更加顯著，對(duì)3 mg/L 的Cd 的去除效率最高，且隨加菌量的增加耐性菌對(duì)Cd 的去除總體呈上升趨勢(shì)。但在Cd 的濃度為12.5 mg/L 時(shí)，加菌量的增加會(huì)抑制耐性菌對(duì)Cd的去除。此外，隨著處理時(shí)間的增加，耐性菌對(duì)Cd的去除率不斷地增加。