張 宸 ，高賢嫻 ，楊 楠 ，王丹妮 ，洪 鐵 ，

（1.吉林大學藥學院藥理教研室，長春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學院，長春130012；）

慢性腎功能衰竭（Chronic renal failure，CRF）又簡稱慢性腎衰，可由各種疾病如腎小球腎炎、泌尿系統(tǒng)先天畸形、遺傳性疾病等逐漸發(fā)展而來[1]。CRF進展緩慢，但病程發(fā)展一般不可逆，而且病程的某一階段可呈進行性發(fā)展和加重，直至發(fā)展成尿毒癥。目前患得該病的人數(shù)達到數(shù)千萬，臨床上主要采取透析、降脂、抗聚、抗凝等治療措施以緩解CRF癥狀并延緩病程發(fā)展[2～3]。近年來，CRF也引起了中醫(yī)藥研究者的關注，益腎降濁膠囊具有補腎健脾、益氣利水的功效，又可以逆降清濁、活血化瘀。本文通過制備CRF大鼠模型并灌胃給予益腎降濁膠囊進行干預治療，探討益腎降濁膠囊對CRF的保護作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于SPF級清潔環(huán)境中，標準飼料喂養(yǎng)，自由進食，適應一周。

1.2 實驗藥物

益腎降濁膠囊由吉林省中醫(yī)藥科學院提供，該研究中使用的每g藥膏相當于生藥約4.55g；腎衰寧膠囊由云南理想藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗試劑

Scr測定試劑盒、BUN測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒均由北京博奧森生物技術有限公司提供。

1.4 實驗儀器

代謝籠，上海澤雅科教儀器有限公司；BS-124S電子天平，北京塞多利斯系統(tǒng)有限公司；微量移液器，賽默飛世爾儀器有限公司；代謝籠，上海澤雅科教儀器有限公司；超純水系統(tǒng)（AFZ-1002-U），艾科普儀器有限公司；TGL-16B離心機，上海安亭科學儀器廠；全波長酶標儀，Biotek公司；倒置顯微鏡，德國LEICA公司。

2 實驗方法

2.1 陽離子化牛血清白蛋白的制備

按照文獻[4]的方法，取67ml的無水乙二胺液，加入500ml雙蒸水，再加入6mol/l的鹽酸350ml，調(diào)整PH至4.75，冷卻至25℃，進行攪拌，再加入天然牛血清白蛋白（N-BSA）5g溶于25ml重蒸餾水的溶液，攪拌完全后再加入1.8g炭化二亞胺鹽酸鹽（EDCHCI）維持25℃，持續(xù)攪拌2h，保持PH值4.75，最后加4mol/l的醋酸緩沖液30ml，終止反應，即得到等電點提高的C-BSA溶液，將C-BSA溶液置于透析袋中，用4℃的雙蒸水透析72h（3～5h換水一次），冷凍干燥后，即得BSA凍干粉。密封保存于80℃冰箱內(nèi)，注射前用0.01mol/l的PH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成溶液。

2.2 構(gòu)建模型

按照文獻[5]的方法建立膜性腎病模型，實驗動物適應性喂養(yǎng)一周后，測24h尿蛋白，選擇24h尿蛋白正常的SD大鼠60只，10只作為空白對照組，另外50只進行預免疫和致病免疫。預免疫：C-BSA100mg溶于3.75mlPBS中，加入26.25ml弗氏不完全佐劑充分混合乳化，除正常組外，在其余大鼠的雙側(cè)腋下、背部及腹股溝多個位置皮下注射（每只大鼠注射0.3ml，每點注射不超過0.05ml），每隔1日進行1次。致病免疫：在預免疫一周后，開始正式免疫，大鼠每隔1日尾靜脈注射C-BSA3.5mg/只，每周注射3次，連續(xù)注射4周。

2.3 動物分組及給藥

未進行模型制作的10只大鼠作為空白對照組，將模型大鼠分為模型對照組、腎衰寧組、益腎降濁膠囊高、中、低劑量組，每組10只。每天灌胃給藥一次，正常對照組及模型對照組給予同體積蒸餾水，連續(xù)給藥6周。

2.4 觀察及檢查指標

2.4.1 大鼠一般情況

治療完成后，觀察各組大鼠的一般生存狀況，包括精神狀態(tài)、外觀、飲食狀況、死亡情況等。

2.4.2 24h尿蛋白量

分別于造模結(jié)束第0周、第2周、第4周、第6周將大鼠置于代謝籠中，收集大鼠的24h尿液，并記錄尿量，測定24h尿蛋白量。

2.4.3 血清腎功能指標檢測

實驗結(jié)束后腹主動脈取血，檢測血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）的含量，具體方法按照試劑盒標示方法進行。

2.4.4 腎臟組織病變的觀察

取大鼠右側(cè)腎臟置于4%的多聚甲醛溶液固定72h，然后進行石蠟包埋、切片、展片和蠟脫水化處理，在常規(guī)HE染色后通過導致光學顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2.4.5 SOD活性和MDA含量的測定

取左側(cè)腎臟、加入適量裂解液進行研磨勻漿，離心后取上清液，測定腎臟組織的超氧化物歧化酶SOD活性和MDA含量，具體方法按照試劑盒標示方法進行。

2.5 統(tǒng)計方法

收集數(shù)據(jù)，采用SPSS17.0軟件進行分析，根據(jù)檢驗數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，定量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

空白對照組的大鼠精神狀態(tài)佳，飲食飲水正常，毛色光澤順滑，體重逐漸增加。在造模過程中未出現(xiàn)大鼠的死亡，但模型組的大鼠呈現(xiàn)精神不振，反應遲鈍，食量明顯減少，飲水大量增加，尿量明顯增多，毛色發(fā)黃、無光澤。經(jīng)益腎降濁膠囊給藥治療后，各藥物組大鼠的精神狀態(tài)隨著用藥時間的延長而精神狀態(tài)逐漸變好，活動強度增加，進食量增加明顯。

3.2 益腎降濁膠囊對CRF大鼠24h尿蛋白定量的影響

造模結(jié)束后，在進行給藥治療前模型組與各給藥組24h尿蛋白量無顯著性差異（P＞0.05）；與空白對組相比，模型對照組與給藥組24h尿蛋白量明顯增加（P＜0.01）。經(jīng)益腎降濁膠囊治療6周后，各組大鼠的24h尿蛋白明顯低于模型組，結(jié)果具有顯著性差異（P＜0.01）。 結(jié)果見表 1。

表1 各組大鼠不同時段24h尿蛋白定量

3.3 益腎降濁膠囊對血清腎功能監(jiān)測指標的影響

與空白對照組相比，CRF模型組大鼠血清中的Scr與BUN含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，益腎降濁膠囊給藥組組均能降低CRF模型大鼠的Scr和BUN的含量，具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 益腎降濁膠囊對CRF大鼠血清中Scr和BUN的影響

3.4 益腎降濁膠囊對CRF大鼠腎組織病理學的影響

通過對各組大叔腎組織病理分析顯示，空白對照組大鼠的腎組織腎小球結(jié)構(gòu)與數(shù)量正常，腎小管結(jié)構(gòu)正常，官腔未見萎縮。模型組大鼠的腎組織存在局部腎單位萎縮、腎小管上皮細胞空泡變性，腎小球囊腔及腎小管存在明顯擴張，腎間質(zhì)大量炎性細胞浸潤。經(jīng)益腎降濁膠囊治療后，上述病理變化較模型組顯著改善。結(jié)果見圖1。

3.5 益腎降濁膠囊對CRF大鼠腎臟組織SOD活性和MDA含量的影響

圖1 益腎降濁膠囊組對CRF大鼠病理變化的影響（HE 400）

與空白對照組相比，模型組的SOD活性顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)益腎降濁膠囊治療6周后，與模型組相比，各治療組的SOD活性均呈現(xiàn)上升趨勢。與空白對照組相比，模型組的MDA含量明顯高于空白對照組，有顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，益腎降濁膠囊給藥組的MDA的含量降低明顯，具有顯著性差異。 （P＜0.05）。 結(jié)果見表 3。

表3 益腎降濁膠囊對CRF大鼠抗氧化酶和MDA含量的影響

4 討論

本實驗對SD大鼠尾靜脈注射C-BSA 4周后，動物出現(xiàn)萎靡不振、脫毛、攝食減少等反應，出現(xiàn)大量蛋白尿、血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）顯著增加，說明腎功能嚴重受損。并且在光學顯微鏡下觀察到腎小球、腎小管的病變，說明膜性腎病誘發(fā)大鼠慢性腎衰是成功的。

CRF主要病機是氣機升降失常[6]，中藥對于慢性疾病的治療有獨特之處，中醫(yī)認為該病屬于“關格”、“癃閉”、“水腫”等范疇[7～8]。 因此，對于 CRF 的治療，在健脾補腎、祛濕化濁、活血化瘀的基礎上，還要考慮運用藥物的四氣五味、升降浮沉來恢復臟腑的氣機的升降特性。益腎降濁膠囊是吉林省中醫(yī)科學院臨床專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導，在長期臨床實踐中總結(jié)出的方劑。該藥物由熟地黃、杜仲、補骨脂、仙靈脾、女貞子、紅參、黃芪、白術等十二味中藥組成，方中以熟地黃補血養(yǎng)陰、益腎填精，杜仲溫補肝腎，二者相伍，雙補腎之陰陽，共為君藥。補骨脂補腎壯陽、固精暖脾，仙靈脾補腎壯陽，黃芪健脾補氣，利水消腫，紅參大補元氣，四者即可助君藥增強補腎溫陽之力，又可健脾益氣、利水消腫，共為臣藥。其他六種中藥助君臣增強補腎健脾、益氣利水之效，又可泥降清濁解毒，兼有活血化瘀之功，全方共奏補腎健脾、降逆清濁之效。

本文通過對CRF大鼠采用益腎降濁膠囊治療后，檢測各組大鼠的腎功能指標，結(jié)果顯示與空白對照組相比，模型組大鼠的24h尿蛋白量，血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平顯著升高。經(jīng)過益腎降濁治療后，治療組的大鼠的腎功能指標顯著降低。通過對大鼠組織進行病理分析顯示，益腎降濁膠囊能夠明顯改善腎組織的萎縮、擴張等情況。同時，益腎降濁膠囊能夠提高SOD活性、降低MDA，具有明顯的抗氧化作用。氧化應激是腎臟疾病進展的重要因素，益腎降濁膠囊能夠增加機體中SOD活性從而提高機體清除氧自由基的能力，減輕自由基對腎小球的損傷，從而延緩慢性腎衰的進程。

綜上所述，益腎降濁膠囊可改善大鼠一般生存狀態(tài)、改善腎功能、抑制腎臟組織病變，產(chǎn)生抗氧化作用，說明益腎降濁膠囊能夠緩解大鼠慢性腎功能衰竭。