李建英，李曉彤 ，翁 紅，王道新 ，紀(jì)麗巖 ，祁宇祥 ，王 波 ，米廣明

（1.長白山制藥股份有限公司，吉林132500；1.延邊大學(xué)，延邊133002）

康艾注射液具有益氣扶正，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。用于原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌、婦科惡性腫瘤等疾病?？蛋⑸湟褐饕现蝗藚⑺幱脷v史悠久，古有“補(bǔ)藥之長”之稱，為歷代中醫(yī)最常用的中藥之一。人參為五加科植物人參 （Panax ginseng C.A.Mey）干燥的根。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，人參具有“主補(bǔ)五臟，安精神，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智”的功效。其在中醫(yī)藥臨床領(lǐng)域，具有悠久的歷史，隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，對人參的研究也得到進(jìn)一步的發(fā)展。人參作為單方或復(fù)方中的重要組成之一，已經(jīng)被開發(fā)成很多中成藥[1～4]，其中也包括注射劑。人參皂苷Re和Rg1是人參藥材中的重要有效成分，其含量測定方法和指紋圖譜分析[5～8]有很多文獻(xiàn)報道。但目前對于中藥制劑中間體的質(zhì)量控制研究相對較少。作為含人參中藥復(fù)方制劑中間體的中人參皂苷Re和Rg1的質(zhì)量控制研究也尤為重要，其含量會影響中藥制劑最終產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，本文采用高效液相法首次測定作為康艾制劑中間體的不同批次人參提取液中人參皂苷Re和Rg1的含量和指紋圖譜，為中藥制劑生產(chǎn)的全程質(zhì)量監(jiān)控提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀 （Agilent 1200 VWD檢測器；Agilent 1200 ALS自動進(jìn)樣器；Agilent 1200 Bin pump；Agilent Chemstation 色 譜工作 站 ）；METTLER AG245十萬分之一天平。

1.2 試藥

人參皂苷Re對照品（批號：110754-200822；純度：88.8%；中國藥品生物制品檢定所）；人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201530；純度：91.7%；中國藥品生物制品檢定所）；實驗中所用乙腈、甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

人參提取液樣品由長白山制藥股份有限公司提供。

2 色譜條件

色譜柱：島津 VP-ODS（4.6 50 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（20：80）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：203 nm。

3 實驗方法與結(jié)果

3.1 供試溶液的制備

3.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷 Re、Rg1對照品 4.60 mg、4.50 mg，置于100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含人參皂苷Re和人參皂苷Rg1分別為0.0408 mg和0.0413 mg的對照品混合溶液。

3.1.2 供試品溶液的制備

取樣品溶液0.2 mL，加80%甲醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，分析前用微孔濾膜（0.22μm）濾過，濾液作為供試品溶液。

3.2 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

取3.1.2項下供試品溶液5μL，注入高效液相色譜儀測試。對照品及樣品色譜圖分別見附圖1、2。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍實驗

精密吸取上述配制好的對照品混合溶液0.5、1、5、10、15、16μL依次注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下分別測定其中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的峰面積(A)，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品的量（mg）為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程分別為：人參皂苷 Rg1：Y=372.73X-0.7504，r=0.9998；人參皂苷 Re：Y=309.42X+1.4858，r=0.9992。 人參皂苷 Rg1和人參皂苷 Re分別在 0.0207～0.6608 μg，0.0204～0.6120μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.4 精密度實驗

分別精密吸取人參皂苷Rg1、Re對照品溶液各5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果見表1。

表1 精密度實驗

結(jié)果表明：儀器精密良好。

3.5 穩(wěn)定性實驗

精密吸取同一供試品溶液 5μL，于0，2，4，6，8，10 h 注入高效液相色譜儀，分別測定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的峰面積，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為1.20%和1.70%，結(jié)果表明：樣品中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re在10 h內(nèi)均穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性實驗

取同一批次樣品，按3.1.2項下制備方法，分別制備6份供試品溶液，各取5μL注入高效液相色譜儀分別測定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2.75%和2.39%。結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

3.7 加樣回收率實驗

分別取已知含量的同一供試品溶液6份，精密稱定，分別加入一定量的人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對照品，分別取5μL注入高效液相色譜儀測定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實驗

3.8 樣品測定

分別精密吸取3.1.2項下制備好的供試品溶液10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，分別計算各樣品中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量，結(jié)果見表3。

表3 人參提取液中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量

結(jié)果：各批中樣品中的人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量分別為 6.48～9.17 mg/ml和 7.40～9.55 mg/ml。

3.9 指紋圖譜的建立與分析

共有峰的標(biāo)定：通過對8批樣品分析，將色譜圖5～60 min內(nèi)的7個色譜峰定為共有峰 （見附圖3），其中，特征峰1相對峰高較高，分離度較好，保留時間也比較穩(wěn)定，因此，選擇這個特征峰作為指紋圖譜的參照物色譜峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，確定其為Rb1，結(jié)果見附圖4。

3.9.1 相似度分析

8批樣品的HPLC色譜圖，采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2012 A版)進(jìn)行分析，計算出人參提取液指紋圖譜的相似度。8批人參提取液的色譜指紋圖譜見附圖5，以8批樣品均值生成的共有模式為對照，計算各批樣品的相似度，結(jié)果見表4。

表4 8批人參提取液指紋圖譜相似度結(jié)果

4 討論

4.1 由于人參提取液濃度較大，根據(jù)相關(guān)工藝情況，本實驗分別考察了80%甲醇、75%乙醇、水3種不同溶劑作為稀釋溶劑的供試品溶液的方法，結(jié)果表明，用80%甲醇稀釋人參提取液獲得的供試品溶液的HPLC色譜峰形較好，提取效率較高，分離度較好，有利于人參提取液的含量測定。通過加樣回收率實驗進(jìn)行準(zhǔn)確度考察，最終確定上述供試品溶液制備方案。

4.2 本實驗進(jìn)行了色譜柱考察?？疾斓纳V柱包括：Intersil ODS-3(4.6 150 nm 5μm）柱、ZoRBA SB-C18(4.6 250mm 5 μm）柱、島津 VP-ODSC18（4.6 50 mm，5μm）柱。結(jié)果表明，島津VP-ODSC18色譜柱分離度較好。

5 小結(jié)

綜上所述，本論文建立了應(yīng)用HPLC法同時測定康艾注射液中間產(chǎn)品人參提取液中的人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量的方法及指紋圖譜的建立。該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于人參提取液的質(zhì)量控制。

附圖：