李 穎 張曉龍 慈 穎 劉瑩瑩 楊 燕 曹曉梅

(中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

蚊蟲是一類重要的醫(yī)學(xué)媒介，不同種屬蚊蟲傳播的病原有差別，伊蚊可傳播登革熱、基孔肯雅熱以及黃熱病等多種疾病(邊長玲等，2009；馬孟哲等，2019)，而庫蚊則可傳播流行性乙型腦炎，因此蚊種鑒定對蚊媒疾病的防控有重要意義。目前，用于蚊蟲的分類鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定目前多限于成蚊和4齡幼蟲的形態(tài)鑒別(孫立新等，2010)，并且受采集過程、采集方法及標(biāo)本運送過程的影響，當(dāng)專業(yè)人員鑒定時，許多蚊蟲標(biāo)本已殘缺不全，難以進(jìn)行準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定分類，或者受蚊種鑒定人員的水平所限，鑒定結(jié)果產(chǎn)生偏差。分子生物學(xué)鑒別技術(shù)從分子水平上闡明物種間的差別，不受樣本形態(tài)完整程度、齡期等的限制，所需樣本量少，是解決蚊蟲分類難題的有效手段。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一種由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶參與的恒溫擴(kuò)增新技術(shù)，可實現(xiàn)較低溫度(23℃～45℃)核酸快速(5～20 min)擴(kuò)增(杜亞楠等，2018)。自2006年RPA技術(shù)問世以來，已取得長足發(fā)展，與不同的檢測方法結(jié)合建立了實時熒光RPA、RPA-LFD(側(cè)流層析試紙條檢測)、RPA-ELISA等技術(shù)，在病毒與細(xì)菌檢測、動植物檢驗檢疫、食品安全檢測與基因突變等方面得到廣泛應(yīng)用。

本研究根據(jù)白紋伊蚊Aedesalbopictus、埃及伊蚊Ae.aegypti的rDNA-ITS2序列，建立了伊蚊實時熒光RPA鑒定方法，實現(xiàn)了對白紋伊蚊、埃及伊蚊的特異性鑒別，可用于常見伊蚊的現(xiàn)場鑒定，并為其他蚊種的分類鑒定研究提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲樣本

白紋伊蚊Aedesalbopictus、埃及伊蚊Ae.aegypti、 刺擾伊蚊Ae.vexans、背點伊蚊Ae.dorsalis樣本由大連國際旅行衛(wèi)生保健中心饋贈，三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus、中華按蚊An.ophelessinensis、常型曼蚊Mansoniauniformis為本實驗室保存樣本。樣本依據(jù)《中國重要醫(yī)學(xué)昆蟲分類與鑒別》、《中國國境口岸醫(yī)學(xué)媒介生物鑒定圖譜》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2 主要試劑與儀器

熒光RPA反應(yīng)試劑盒(Twist AmpTMExo Kits)、基礎(chǔ)RPA反應(yīng)試劑盒(Twist AmpTMBasic Kits)為TwistDx公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增試劑(TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DNAMarker為TaKaRa公司產(chǎn)品；核酸提取試劑盒(血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒)為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。PCR儀為ABI 7500 Fast熒光PCR儀和ABI 2700 PCR儀。

1.3 核酸提取

白紋伊蚊、埃及伊蚊樣本各5只，刺擾伊蚊、背點伊蚊、三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊樣本各3只，單只蚊蟲樣本整只研磨提取核酸。使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根)提取單蚊基因組DNA。

1.4 引物和探針設(shè)計篩選

參考文獻(xiàn)(耿藝介等，2008；師永霞等，2008；劉飛等，2015；尹小平等，2016)選擇白紋伊蚊和埃及伊蚊的第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2序列為目的基因，在GenBank中查找相關(guān)序列，按Twistamp-assay-design技術(shù)要求應(yīng)用Oligo7軟件設(shè)計引物和探針，通過Blast比對確定其特異性，然后用基礎(chǔ)RPA對引物進(jìn)行初篩，確定使用表1中所列的引物和探針進(jìn)行后續(xù)實驗。引物和探針均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1 本實驗所用候選引物和探針

將基礎(chǔ)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，測序結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行Blast比對分析。同時，依據(jù)參考文獻(xiàn)(Folmeretal.,1994；廉國勝等，2015)以相同樣本的DNA為模板進(jìn)行COI序列擴(kuò)增，然后進(jìn)行測序、Blast比對分析，比較兩種方法的結(jié)果，以驗證RPA鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.5 反應(yīng)體系和條件

熒光RPA反應(yīng)體系(50 μL)：Primer Free Rehydration buffer 29.5 μL，無核酸酶水 11.2 μL，正向引物(10 μmol/L)2.1 μL，反向引物(10 μmol/L)2.1 μL，探針(10 μmol/L)0.6 μL，模板2 μL，將上述溶液加至熒光RPA凍干酶粉反應(yīng)管中，再加入280 mmol/L MgOAc 2.5 μL?；旌暇鶆蚝?，分裝20 μL至0.1 mL PCR反應(yīng)管中，立即置于熒光PCR中開始反應(yīng)。反應(yīng)條件為39℃，30 s(收集熒光)，40個循環(huán)(反應(yīng)時間共20 min)。

基礎(chǔ)RPA反應(yīng)體系(50 μL)：Primer Free Rehydration buffer 29.5 μL，無核酸酶水 11.2 μL，正向引物(10 μmol/L)2.4 μL，反向引物(μmol/L)2.4 μL，模板2 μL，將上述溶液加至基礎(chǔ)RPA凍干酶粉反應(yīng)管中，再加入280 mmol/L MgOAc 2.5 μL，混勻后立即放入39℃恒溫金屬浴中開始反應(yīng)，反應(yīng)時間20 min。

COI擴(kuò)增反應(yīng)體系：白紋伊蚊COI序列擴(kuò)增所用引物參考廉國勝等(2015)文獻(xiàn)，埃及伊蚊COI序列擴(kuò)增所用引物參考Folmer等(1994)文獻(xiàn)(表1)。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Master Mix 12.5 μL，無核酸酶水 9 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2.5 μL。

1.6 特異性試驗

采用篩選的引物和探針，分別以白紋伊蚊、埃及伊蚊、刺擾伊蚊、背點伊蚊、三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊DNA為模板，用RPA Exo試劑盒進(jìn)行熒光RPA檢測，驗證其特異性。

1.7 靈敏度試驗

測定DNA樣本濃度，經(jīng)過適當(dāng)稀釋，稀釋至1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，進(jìn)行熒光RPA檢測，測試該方法的靈敏度。

1.8 重復(fù)性試驗

將上述稀釋的DNA樣本進(jìn)行重復(fù)性實驗，每個濃度進(jìn)行3次重復(fù)檢測，分析該方法的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 rDNA-ITS2序列基礎(chǔ)RPA擴(kuò)增結(jié)果和COI序列擴(kuò)增結(jié)果比較

圖1 篩選引物基礎(chǔ)RPA擴(kuò)增結(jié)果

用大連國際旅行衛(wèi)生保健中心提供的白紋伊蚊和埃及伊蚊樣本提取DNA，以此為模板，以篩選出的引物進(jìn)行基礎(chǔ)RPA擴(kuò)增，同時進(jìn)行COI序列擴(kuò)增。白紋伊蚊用5個樣本進(jìn)行了重復(fù)實驗，結(jié)果如圖1、2。篩選出的白紋伊蚊引物擴(kuò)增目標(biāo)片段大小為219 bp，篩選出的埃及伊蚊引物擴(kuò)增目標(biāo)片段大小為132 bp。從圖1看出，5個白紋伊蚊和埃及伊蚊均有目標(biāo)大小條帶。基礎(chǔ)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序，測序結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行Blast比對，白紋伊蚊擴(kuò)增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中白紋伊蚊rDNA-ITS2序列相似性均>98%，可判斷為白紋伊蚊；埃及伊蚊RPA擴(kuò)增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中埃及伊蚊rDNA-ITS2序列相似性均>98%(王剛，2011；Cywinskaetal., 2006)，可判斷為埃及伊蚊。COI序列PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2，5個白紋伊蚊和埃及伊蚊樣本均有目標(biāo)條帶，PCR產(chǎn)物測序后登錄NCBI進(jìn)行Blast比對，結(jié)果分別與白紋伊蚊COI序列相似性>99%、與埃及伊蚊COI序列相似性>99%，可判斷分別為白紋伊蚊和埃及伊蚊。RPA方法蚊種鑒定結(jié)果與COI序列分析結(jié)果一致。

圖2 COI序列PCR結(jié)果

2.2 特異性試驗結(jié)果

伊蚊熒光RPA鑒定方法特異性實驗結(jié)果見圖3、4。白紋伊蚊熒光RPA特異性實驗結(jié)果如圖3所示，僅有白紋伊蚊樣本有擴(kuò)增曲線，其他蚊種和空白對照均沒有擴(kuò)增曲線，表明篩選出的白紋伊蚊引物和探針與埃及伊蚊、刺擾伊蚊、背點伊蚊、三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊DNA均無交叉反應(yīng)。埃及伊蚊熒光RPA特異性實驗結(jié)果如圖4所示，僅有埃及伊蚊產(chǎn)生了擴(kuò)增曲線，其他蚊種和空白對照均未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，表明篩選出的埃及伊蚊引物和探針與白紋伊蚊、刺擾伊蚊、背點伊蚊、三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊DNA均無交叉反應(yīng)。

2.3 靈敏度實驗結(jié)果

檢測樣本DNA的濃度，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，稀釋至1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，進(jìn)行熒光RPA檢測，結(jié)果如圖5、6。白紋伊蚊和埃及伊蚊樣本濃度在10-3～1 ng/μL范圍內(nèi)均可產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，10-4ng/μL和空白對照均無擴(kuò)增曲線。但當(dāng)濃度稀釋至10-3ng/μL時雖有擴(kuò)增曲線，但結(jié)果不穩(wěn)定(見2.4部分)，因此，將0.01 ng/μL作為本方法的檢出限。

圖3 白紋伊蚊熒光RPA特異性檢測

圖4 埃及伊蚊RPA特異性實驗結(jié)果

圖5 白紋伊蚊熒光RPA靈敏度實驗結(jié)果

圖6 埃及伊蚊熒光RPA靈敏度試驗結(jié)果

圖7 白紋伊蚊熒光RPA重復(fù)性實驗結(jié)果

圖8 埃及伊蚊熒光RPA重復(fù)性實驗結(jié)果

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果

2.4 重復(fù)性實驗結(jié)果

選取上述稀釋濃度的DNA樣本，進(jìn)行重復(fù)性實驗，每個濃度3個平行，結(jié)果如圖7、8和表2。濃度在10-2～1 ng/μL時，相同濃度的檢測結(jié)果一致，變異系數(shù)均小于5%。當(dāng)稀釋至10-3ng/μL時，雖有擴(kuò)增曲線，但熒光信號與空白接近，而且變異系數(shù)較大，尤其白紋伊蚊在10-3ng/μL時變異系數(shù)達(dá)到14.08%。實驗結(jié)果表明，當(dāng)模板濃度在方法檢出限0.01 ng/μL以上時檢測結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性良好。

3 討論

蚊蟲是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲，對其進(jìn)行分類鑒定研究對防控蚊媒傳染病具有重要的意義。長期以來，蚊種的分類鑒定以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定為主，但對于形態(tài)相似的近緣種、形體不完整的樣本以及幼蟲，利用形態(tài)學(xué)很難進(jìn)行準(zhǔn)確的種類鑒定。分子生物學(xué)方法是從DNA水平進(jìn)行蚊種鑒定，是解決上述問題的有效手段，現(xiàn)有的分子鑒別技術(shù)有DNA探針技術(shù)、PCR和測序技術(shù)、RAPD技術(shù)、RFLP技術(shù)等(孫立新等，2010；彭淑瓊等，2010)，但由于上述技術(shù)中有些需要特定設(shè)備，有的操作繁雜，有的還需要進(jìn)行生物信息學(xué)分析，因此在現(xiàn)場快速檢測中的應(yīng)用受到一定限制。熒光RPA技術(shù)是一種新型的等溫快速檢測技術(shù)，該方法可在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，操作簡單，無需熱循環(huán)過程，縮短了檢測時間，同時減少了能量和成本，特異性好，靈敏度高(杜亞楠等，2018)，已在病毒檢測(馬磊等，2019；林彥星等，2019)、細(xì)菌檢測(李軻等，2019；劉婧文等，2020)、食品安全(林霖等，2018；謝實龍等，2019)等方面得到很好應(yīng)用。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)不參與核糖體形成，受到的選擇壓力小，進(jìn)化速度快，適合于屬間、種間的系統(tǒng)發(fā)育和種群分化方面的研究，尤其是ITS2種內(nèi)相對保守，而種間存在一定的差異，可應(yīng)用于近緣種的鑒定和種群間分化程度研究(江世宏等，2008)。師永霞等(2008)等利用rDNA-ITS2對致倦庫蚊、三帶喙庫蚊、白紋伊蚊、騷擾阿蚊和中華按蚊進(jìn)行了分子鑒定，其結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定一致，說明rDNA-ITS2的分子鑒定可成功應(yīng)用于成蚊和幼蚊的亞科、屬和種的區(qū)分。郭秀霞(2020)等利用rDNA-ITS2對淡色庫蚊、三帶喙庫蚊、二帶喙庫蚊、白紋伊蚊、刺擾伊蚊、中華按蚊、騷擾阿蚊、常型曼蚊和黃色柯蚊成蚊進(jìn)行了分子鑒定，分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定吻合率100%，說明rDNA-ITS2基因可用于蚊蟲屬和種的鑒定。

本研究對熒光RPA伊蚊鑒定方法進(jìn)行了初探，初步建立白紋伊蚊和埃及伊蚊的熒光RPA鑒定方法，特異性良好，與伊蚊屬部分蚊種以及三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊DNA均無交叉反應(yīng)。在39℃，20 min即可完成檢測。對目的DNA的檢測限為0.01 ng/μL，3個平行的變異系數(shù)值均<5%，顯示了良好的重復(fù)性。本研究還用相同的引物，采用基礎(chǔ)RPA方法進(jìn)行了擴(kuò)增、測序、BLAST比對分析，其鑒定結(jié)果顯示與COI序列分析鑒定結(jié)果一致，進(jìn)一步驗證了建立的熒光RPA方法的準(zhǔn)確性。而且，熒光RPA方法和基礎(chǔ)RPA的方法相比，省去了DNA純化和凝膠電泳的繁瑣步驟而更加簡便，可實時觀察檢測結(jié)果，為病媒生物鑒定提供了新的技術(shù)方法，非常適合于蚊蟲的現(xiàn)場快速檢測，對蚊媒病的防控具有重要意義。

本研究僅以白紋伊蚊和埃及伊蚊為例進(jìn)行了熒光RPA伊蚊鑒定方法的初探，其他伊蚊的熒光RPA鑒定方法的建立及優(yōu)化需要進(jìn)行后續(xù)研究，并且在后續(xù)研究中會考慮以所鑒定蚊種的近緣種作為對照，進(jìn)一步驗證方法的特異性。