鐘愛華 儲(chǔ)張杰 王偉洪 牟 毅

泥蚶()血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組序列中免疫相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與mRNA表達(dá)量分析*

鐘愛華 儲(chǔ)張杰 王偉洪 牟 毅

(浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 舟山 316022)

貝類血細(xì)胞直接參與異物吞噬和包囊作用, 還在傷口修復(fù)、炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用, 是機(jī)體免疫防御的承擔(dān)者。本研究采用RNA-seq測(cè)序技術(shù)研究了鰻弧菌感染前后泥蚶血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組序列, 通過序列組裝, 獲得了α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-甘露糖苷酶(LAMAN)、芳基硫酸酯酶B(ASB)、天冬酰胺氨基葡萄糖酶(AGA)、整合素β3亞基(ITB3)、熱休克蛋白9(HSPA9)和Toll相互作用蛋白(TOLLIP)序列, 利用Orffinder獲得了其編碼蛋白序列, 并對(duì)蛋白序列進(jìn)行了理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明: 7種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲, 泥蚶和人類ITB3和TOLLIP具有相同的保守結(jié)構(gòu)域, Swiss-model同源建模獲得的三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板同源性均超過35%(TOLLIP除外)。鰻弧菌刺激后, GAA、LAMAN、ASB、AGA和HSPA9的表達(dá)量顯著增加, ITB3和TOLLIP表達(dá)量變化不明顯。該研究補(bǔ)充和完善了對(duì)泥蚶免疫相關(guān)基因的認(rèn)識(shí), 并為進(jìn)一步開展泥蚶抗病機(jī)理研究提供了重要的理論依據(jù)。

泥蚶; 血細(xì)胞; 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序; 免疫基因

泥蚶()屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、列齒目(Taxodonta)、蚶科(Arcidae), 富含營養(yǎng), 且含有特有的維生素B12和血紅蛋白, 味道鮮美, 具有補(bǔ)血養(yǎng)胃和除淤散積的功效, 是我國傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類(李太武等, 2003)。血細(xì)胞是機(jī)體抵抗病原微生物的重要載體, 貝類血細(xì)胞能吞噬病原微生物或形成包囊包裹異物, 還在傷口修復(fù)、炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用(孫敬鋒等, 2006)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing)是利用大規(guī)模測(cè)序技術(shù)直接對(duì)cDNA序列進(jìn)行測(cè)序的技術(shù), 能獲得細(xì)胞在某一狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA。RNA-seq具有通量高、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn), 是一種有效的基因組研究和功能基因鑒定方法, 利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究轉(zhuǎn)錄譜特征近年來呈爆發(fā)式增長(陳雪峰等, 2019; Wang, 2019)。目前有關(guān)泥蚶研究主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)、病害防控以及單一基因克隆(李太武等, 2003; 董迎輝等, 2013; Liu, 2017; 許家輝等, 2018)等方面。本研究采用RNA-Seq技術(shù)測(cè)序了鰻弧菌刺激前后泥蚶血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組, 通過轉(zhuǎn)錄組序列組裝獲得了7個(gè)免疫相關(guān)基因蛋白序列, 并對(duì)7個(gè)免疫相關(guān)基因蛋白序列理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化發(fā)生和mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了分析, 探索其在細(xì)菌感染過程中所發(fā)揮的作用, 以期為泥蚶抗病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)用泥蚶來自浙江省舟山市沈家門國際水產(chǎn)城, 選擇貝殼無損傷、對(duì)外界刺激反應(yīng)迅速的泥蚶, 帶回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)5d, 暫養(yǎng)鹽度為20±1、溫度(18±2)°C、溶解氧高于5mg/L。暫養(yǎng)結(jié)束后, 隨機(jī)挑選5個(gè)大小相一致的泥蚶置于含有5×106cfu/mL鰻弧菌懸液中, 5個(gè)泥蚶置于無菌海水中。24h后, 采用無菌注射器從兩組泥蚶外套腔中取血, 獲得的血淋巴立即與Trizol (Invitrogen, CA, USA)試劑采按1 : 5混合, 將混合好的血淋巴凍存于液氮中備用。

1.2 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建與測(cè)序

按照TRIzol?Reagent試劑盒操作步驟提取總RNA, 提取的總RNA采用Bioanalyzer 2100和RNA 1000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA)定性定量試劑盒進(jìn)行質(zhì)檢, 獲得的RNA滿足總量≥5μg、濃度≥200ng/μL、OD260/OD280為1.8—2.2、RIN >8.0, 進(jìn)行文庫構(gòu)建。先使用連接有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA, 富集的mRNA被片段化試劑(Fragmentation Buffer)隨機(jī)打斷成短片段, 以片段化的mRNA為模板, 用六堿基隨機(jī)引物(Random hexamers)合成一鏈cDNA, 隨后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I進(jìn)行二鏈cDNA合成。AMPure XP beads純化雙鏈產(chǎn)物, 利用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶將DNA的粘性末端修復(fù)為平末端, 3′末端加堿基A并加接頭, AMPureXP beads進(jìn)行片段選擇, 之后用USER酶降解含有U的cDNA第二鏈, 然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得最終測(cè)序文庫。文庫質(zhì)檢合格后采用Illumina Hiseq4000進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序讀長為雙端2*150bp (PE150)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組de novo組裝

測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(Raw Date)采用使用Cutadapt去除測(cè)序reads中接頭后, 使用Fqtrim過濾掉不合格的序列后得到有效數(shù)據(jù)。具體為先對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行窗口法質(zhì)量掃描, 掃描窗口默認(rèn)為6bp, 當(dāng)窗口內(nèi)平均質(zhì)量值低于20時(shí), 將read從窗口起始到3′終止的部分截掉, 去除poly-A/T、去除截?cái)嗪箝L度小于100bp以及N的含量在5%以上的序列, 余下的序列為有效數(shù)據(jù)。過濾后的數(shù)據(jù)(Clean reads), 使用Trinity軟件進(jìn)行從頭組裝, reads首先被拼接成長片段contigs, 去除冗余contigs后將contigs 進(jìn)行分組, 最后連接成兩端不能再延長的轉(zhuǎn)錄片段(Unigene)。

1.4 基因注釋和結(jié)構(gòu)分析

采用軟件DIAMOND, 設(shè)定期望值E Value<1e-5, 在NCBI-NR (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、GO (http:// www.geneontology.org)、KEGG (http://www.genome. jp/kegg/)、Pfam (http://pfam.xfam.org/)和Swiss-Prot (https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì), 獲得Unigenes注釋信息?；谧⑨屝畔? 利用NCBI數(shù)據(jù)庫SmartBlast工具對(duì)7個(gè)候選基因進(jìn)一步進(jìn)行比對(duì), 以保證注釋信息正確, 7個(gè)候選基因編碼區(qū)由NCBI網(wǎng)站獲得(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)。

利用ExPaSy中的ProtParam (http://web.expasy. org/protparam/)對(duì)蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析; 利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析序列保守結(jié)構(gòu)域(包括信號(hào)肽)特征; 利用Prabi程序(https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè); 利用在線工具Swiss-model (http:// swissmodel.expasy.org)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 選取同源性大于30% (Seq Identity)、GMQE和QMEAN值大的模板生成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu), 然后使用PyMOL Viwer軟件進(jìn)行編輯, 最終繪制出蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型圖。

1.5 差異表達(dá)基因分析

采用Salmon軟件(Patro, 2017)將測(cè)序獲得的Clean reads比對(duì)到Trinity組裝的序列, 從而獲得每個(gè)unigene上的read數(shù)目, 然后計(jì)算TPM (Transcripts Per Kilobase Million), 從而獲得Unigene的表達(dá)量。采用R軟件包中的edgeR篩選差異表達(dá)基因, 篩選閾值為值<0.05且|log2Fold Change| >1。

1.6 系統(tǒng)發(fā)生分析

以人類、斑馬魚及其他水生生物作為參考物種, 利用MEGA-X對(duì)7種免疫相關(guān)基因進(jìn)行Clustal W序列比對(duì), 用最大似然法(ML法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹前, 先計(jì)算最優(yōu)模型, 采用最優(yōu)模型進(jìn)行建樹, 同時(shí)進(jìn)行步長循環(huán)1000檢驗(yàn), 所用模型及序列見表1。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、組裝和注釋

通過高通量測(cè)序泥蚶血細(xì)胞中共獲得9.01G raw base和60001612 raw reads, 過濾后獲得8.75G valid bases和59199480 valid reads, valid reads的GC (guanine-cytosine)含量為42.41%, 組裝后, 共獲得21823條Unigenes, 原始數(shù)據(jù)已上傳至國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(https://bigd.big.ac.cn/,Project:PRJCA002006, 提交編號(hào): subCRA002389)。通過與Pfam、NR、GO、Swissprot和KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì), 共有10691條Unigenes與已知基因同源, GO數(shù)據(jù)庫中注釋到8301 (38.04%)條, KEGG中注釋到5376 (24.63%)條, Swissprot中注釋到7686 (35.22%)條, Pfam中注釋到9868 (36.05%)條, NR中注釋到10636條(48.74%)條(圖1)。物種同源性分析表明, 與NR數(shù)據(jù)庫中太平洋牡蠣同源序列比例最高, 其次是櫛孔扇貝(圖1)。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹所用模型和序列

Tab.1 Models and sequences for constructing phylogenetic trees

圖1 泥蚶血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組注釋信息

注： a. 不同數(shù)據(jù)庫Unigenes注釋數(shù); b. 同源性分析

2.2 溶酶體酶

泥蚶血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組序列中鑒定出4種溶酶體酶, 包括2種糖苷酶、硫酸酯酶B和天冬酰胺氨基葡萄糖酶。溶酶體α-葡萄糖苷酶(GAA)長度為3168bp, 開放閱讀框長度為2347bp, 編碼779個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量約為 87.9kDa、理論等電點(diǎn)6.68; 絲氨酸和蘇氨酸含量最高, 占7.7%; 不穩(wěn)定系數(shù)為34.03, 屬于穩(wěn)定蛋白。其N端(第1—96位氨基酸)是一個(gè)β桶狀結(jié)構(gòu), 一般位于真核生物麥芽糖酶-葡糖淀粉酶催化域的N端, 屬于糖基水解酶31的N-末端保守結(jié)構(gòu)域; 第97—163氨基酸屬于糖苷水解酶家族31的保守結(jié)構(gòu)域; 第183—651氨基酸為O-糖基水解酶31結(jié)構(gòu)域(圖2a)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析其含有α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲。SWISS同源性分析顯示泥蚶溶酶體α-葡萄糖苷酶與模板5kzw.1.A、5nn3.1.A同源性均超過50%, 自動(dòng)建模只有一種三級(jí)結(jié)構(gòu)被建立(圖6a)。多重序列比對(duì)顯示泥蚶α-葡萄糖苷酶與人、小鼠和斑馬魚同源性為50%左右, 與太平洋牡蠣、美洲巨牡蠣和蝦夷扇貝同源性超過60%; 系統(tǒng)進(jìn)化樹表明泥蚶α-葡萄糖苷酶與蝦夷扇貝優(yōu)先聚為一支, 然后與太平洋牡蠣和美洲巨牡蠣相聚(圖2b)。

圖2 α-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)域(Pfam數(shù)據(jù)庫)和系統(tǒng)進(jìn)化樹

注： a. 結(jié)構(gòu)域; b. 系統(tǒng)進(jìn)化樹

溶酶體α-甘露糖苷酶(LAMAN)長度為3473bp, 開放閱讀框長度為3180bp, 編碼1060個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量約為120.9kDa、理論等電點(diǎn)8.77; 含量最高的氨基酸為亮氨酸, 占9.4%; 不穩(wěn)定系數(shù)為32.94, 屬于穩(wěn)定蛋白; 二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲組成。其N端(第1—24位氨基酸)具有信號(hào)肽, 第43—360氨基酸屬于糖苷水解酶家族38的保守結(jié)構(gòu)域, 第365—442為α-甘露糖苷酶中間保守結(jié)構(gòu)域, 第491—1054氨基酸為糖苷水解酶家族38的C端保守結(jié)構(gòu)域(圖3a); 三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示其與Swiss-Model數(shù)據(jù)庫中α-甘露糖苷酶模板1o7d.1.A和1o7d.1.B同源性超過60%, 與模板1o7d.1.D同源性超過55%, 自動(dòng)建模獲得地三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖6b。多重序列比對(duì)顯示其與人、斑馬魚、美洲巨牡蠣和蝦夷扇貝同源性超過50%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示泥蚶α-甘露糖苷酶與美洲巨牡蠣親緣關(guān)系最近(圖3b)。

芳基硫酸酯酶B(ASB)長度為1743bp, 開放閱讀框?yàn)?536bp, 編碼512個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量約為 59.1kDa、理論等電點(diǎn)6.32; 含量最高的氨基酸為甘氨酸, 占8.2%; 不穩(wěn)定系數(shù)為47.08, 屬于不穩(wěn)定蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析其含有α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲。其N端具有信號(hào)肽和硫酸酯酶結(jié)構(gòu)域(圖4a)。其與Swiss-model數(shù)據(jù)庫中模板 B1fsu.1.A同源性高達(dá)47.01%, 自動(dòng)建模只有一種三級(jí)結(jié)構(gòu)被建立(圖6c)。多重序列比對(duì)顯示其與太平洋牡蠣、美洲巨牡蠣和蝦夷扇貝同源性高達(dá)55%以上, 與人類芳基硫酸酯酶B同源性超過40%; 系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示泥蚶芳基硫酸酯酶B優(yōu)先與蝦夷扇貝聚為一支, 然后與太平洋牡蠣和美洲巨牡蠣相聚(圖4b)。

圖3 溶酶體α-甘露糖苷酶的結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹

注： a. 結(jié)構(gòu)域; b. 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 芳基硫酸酯酶B的結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹

注： a. 結(jié)構(gòu)域; b. 系統(tǒng)進(jìn)化樹

天冬酰胺氨基葡萄糖酶(AGA)長度為1256bp, 開放閱讀框?yàn)?044bp, 編碼348個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量約為120.9kDa、理論等電點(diǎn)8.77; 含量最高的氨基酸為亮氨酸, 占9.4%; 不穩(wěn)定系數(shù)為32.94, 屬于穩(wěn)定蛋白; 具有α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲組成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第16—342位氨基酸殘基是天冬酰胺酶2結(jié)構(gòu)域(圖5a)。三級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示其與模板1p4k.1.A、4r4y.1.A、同源性超過40%, 與模板1apz.1.A同源性為超過60%, 以模板1apz.1.A建立的三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖6d。多重序列比對(duì)顯示其與太平洋牡蠣、美洲巨牡蠣和蝦夷扇貝相似度高達(dá)55%以上, 與人類、斑馬魚、大黃魚等相似度超過50%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示泥蚶天冬酰胺氨基葡萄糖酶優(yōu)先與蝦夷扇貝聚為一支(圖5b)。

圖5 天冬酰胺氨基葡萄糖酶的結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹

注： a. 結(jié)構(gòu)域; b. 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 5種蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)圖

注： a. 溶酶體α-葡萄糖苷酶; b. 溶酶體α-甘露糖苷酶; c. 芳基硫酸酯酶B; d. 天冬酰胺氨基葡萄糖酶; e. 整合素β3亞基

2.3 整合素

泥蚶血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組序列中, 鑒定出整合素β3亞基(ITB3), β3亞基長度為3455bp, 編碼793個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量約為87.9kDa、理論等電點(diǎn)4.94; 蘇氨酸含量最高, 占7.9%; 不穩(wěn)定系數(shù)為44.51, 屬不穩(wěn)定蛋白。SMART保守結(jié)構(gòu)域分析其具有人整合素β3相似結(jié)構(gòu)域, 胞外序列N端有信號(hào)肽和整合素亞基保守結(jié)構(gòu)域(integrin beta subunits domain, INB)(第27—452位氨基酸), 第631—714位氨基酸是整合素β尾部保守區(qū)域, 第714—736位氨基酸為跨膜區(qū)域, 胞內(nèi)有整合素β-cyt結(jié)構(gòu)域, 泥蚶整合素第461—622位氨基酸位置上還有3個(gè)EGF樣(epidermal growth factor)重復(fù)(圖7b)。具有α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲組成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過Swiss-model進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模, 結(jié)果顯示泥蚶整合素β3與模板3ije.1.B、6avr.1.B、6bxj.1.A、4mmy.1.B、4mmx.1.B等同源性均超過35%, 模板6avr.1.B建模效果最優(yōu), 其GMQE(0.63)和QMEAN(-3.31)值均最大, 泥蚶整合素β3三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖6e。NCBI結(jié)果顯示泥蚶整合素β3序列與美洲牡蠣整合素β3同源性超過45%, 與人和斑馬魚同源性超過35%。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明: 泥蚶整合素β3亞基與太平洋牡蠣和美洲巨牡蠣親緣關(guān)系最近(圖7c)。

圖7 整合素β3亞基的結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹

注： a. 人整合素β3亞基保守結(jié)構(gòu)域; b. 泥蚶整合素β3亞基保守結(jié)構(gòu)域; c. 系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 熱休克蛋白

泥蚶血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中鑒定出1種新型熱休克蛋白, 為熱休克蛋白9 (strss-70 protein, mitochondrial, HSPA9)。熱休克蛋白9長度為2189bp, 開放閱讀框長度為2067bp, 編碼688個(gè)氨基酸, 編碼蛋白分子量大小約為75.6kDa、理論等電點(diǎn)6.32; 谷氨酸含量最高, 占8.4%; 不穩(wěn)定系數(shù)為41.96, 屬于穩(wěn)定不蛋白; 具有α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲組成的二級(jí)結(jié)構(gòu); 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示其與模板2kho.1.A、1yuw.1.A和4fl9.1.A同源性超過55%, 以同源性高的模板2kho.1.A生成三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖8a。NCBI多重序列比對(duì)結(jié)果顯示泥蚶熱休克蛋白9氨基酸序列與哺乳類(人, 小鼠)、斑馬魚、太平洋牡蠣和蝦夷扇貝等序列相似度都在70%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明: 泥蚶HSPA9與蝦夷扇貝優(yōu)先聚為一支, 然后與太平洋牡蠣和美洲巨牡蠣相聚, 表明它們之間親緣關(guān)系比較近(圖8b)。

2.5 Toll相互作用蛋白

Toll相互作用蛋白(TOLLIP)長度為995bp, 開放閱讀框?yàn)?67bp, 編碼289個(gè)氨基酸, 分子量約為32.4kDa、理論等電點(diǎn)4.77; 含量最高的氨基酸為谷氨酰胺, 占10.03%; 不穩(wěn)定系數(shù)為57.98, 屬于穩(wěn)定不蛋白; 二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊及無規(guī)則卷曲組成, α螺旋占比最低。第68—165位置上具有C2(蛋白激酶C保守結(jié)構(gòu)域2)結(jié)構(gòu)域, C端第245—287具有toll相互作用蛋白CUE保守結(jié)構(gòu)域(圖9b)。Swiss-model數(shù)據(jù)庫中暫時(shí)沒有toll相互作用蛋白模板。多重序列比對(duì)顯示其與太平洋牡蠣和蝦夷扇貝相似度高達(dá)60%以上, 與人類和斑馬魚等相似度超過50%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示泥蚶toll相互作用蛋白與太平洋牡蠣、美洲巨牡蠣和蝦夷扇貝親緣關(guān)系比較近(圖9c)。

圖8 熱休克蛋白9三級(jí)結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化樹

注： a. 三級(jí)結(jié)構(gòu); b. 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖9 Toll相互作用蛋白的結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹

注： a. 人Toll相互作用保守結(jié)構(gòu)域; b. 泥蚶Toll相互作用蛋白保守結(jié)構(gòu)域; c. 系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6 感染前后7種免疫相關(guān)基因表達(dá)差異

基因豐度反映了基因表達(dá)水平, 鰻弧菌刺激后, 7種免疫相關(guān)基因豐度TPM見圖10, 整合素β3以及Toll相互作用蛋白刺激前后豐度變化不大, 四種溶酶體酶和熱休克蛋白9刺激后表達(dá)豐度顯著增加, 以<0.05且|log2Fold Change| >1進(jìn)行差異基因表達(dá)分析, 四種溶酶體酶和熱休克蛋白9表達(dá)上調(diào)。

圖10 感染前后7種免疫相關(guān)基因表達(dá)量

3 討論

3.1 免疫相關(guān)基因的進(jìn)化特點(diǎn)

本文采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了泥蚶7個(gè)免疫相關(guān)基因序列, 并分析了其一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu), 采用Swiss-model進(jìn)行同源建模, 一般要求序列同源性大于30% (Arnold, 2006; Marco, 2014), 本研究中6個(gè)蛋白序列與Swiss-model數(shù)據(jù)庫中的模板同源性均超過35%, 表明三級(jí)結(jié)構(gòu)可靠。利用最大似然法(ML法)并采用步長循環(huán)1000進(jìn)行進(jìn)化樹檢驗(yàn), 構(gòu)建了7種免疫相關(guān)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示泥蚶與蝦夷扇貝、太平洋牡蠣和美洲巨牡蠣親緣關(guān)系比較近, 四者常聚為一個(gè)緊密的簇; 福壽螺與泥蚶親緣關(guān)系次于三種雙殼貝類; 斑馬魚、大黃魚和人與泥蚶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。與多數(shù)雙殼貝類不同, 泥蚶血液呈紅色, 以血紅蛋白作為呼吸色素, 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示免疫相關(guān)基因與無脊椎動(dòng)物同源性更高些, 這與血細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果相一致, 朱澤聞等(2011)通過研究發(fā)現(xiàn)泥蚶血細(xì)胞由紅色顆粒細(xì)胞、嗜堿性顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞為主, 血細(xì)胞組成上不同于脊椎動(dòng)物。

3.2 溶酶體酶

泥蚶屬低等無脊椎動(dòng)物, 血細(xì)胞在免疫防御中起重要作用, 血細(xì)胞直接參與異物的免疫黏附、包囊、吞噬等過程, 細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的水解作用是殺傷和清除吞噬病原微生物主要途徑, 部分溶酶體酶還能釋放到血淋巴中, 通過改變病原菌表面的分子結(jié)構(gòu), 有利于吞噬細(xì)胞識(shí)別病原微生物(Cheng, 1983)。Carballal等用半定量光密度法(API ZYM試劑盒)測(cè)定了貽貝血細(xì)胞中與免疫防御功能相關(guān)的酶類, 貽貝血細(xì)胞具有α-葡萄糖苷酶活性(Carballal, 1997); Xue等用API ZYM試劑盒在健康歐洲扁牡蠣血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)14種酶, 沒有發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶活性, 原生動(dòng)物感染后血細(xì)胞具有α-葡萄糖苷酶活性(Xue, 2000)。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 健康泥蚶血細(xì)胞中有α-葡萄糖苷酶表達(dá), 細(xì)菌感染后泥蚶血細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶表達(dá)量顯著增加。生理狀態(tài)下, 血細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶是否具有活性, 不同貝類研究結(jié)果不一樣, 表明其存在形式具有種屬特異性, 歐洲扁牡蠣血細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶可能以無活性前體形式存在, 而貽貝是以活性形式存在, 泥蚶α-葡萄糖苷酶分子特征顯示其沒有信號(hào)肽, 長牡蠣和斑馬魚溶酶體α-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示其沒有信號(hào)肽, 而人類α-葡萄糖苷酶前體N端含有信號(hào)肽, 暗示泥蚶血細(xì)胞中溶酶體α-葡萄糖苷酶以活性形式存在。

溶酶體α-甘露糖苷酶也屬于糖苷酶, 參與甘露糖苷鍵水解, 貽貝、歐洲扁牡蠣、太平洋牡蠣血細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)α-甘露糖苷酶, 鰻弧菌感染后泥蚶血細(xì)胞中溶酶體α-甘露糖苷酶表達(dá)量增加, 與太平洋牡蠣研究結(jié)果相似(Xue, 2000)。泥蚶溶酶體α-甘露糖苷酶其序列N端具有信號(hào)肽, 人類和斑馬魚溶酶體α-甘露糖苷酶前體二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示其N端具有信號(hào)肽(Paciotti, 2017), 表明泥蚶血細(xì)胞中溶酶體α-甘露糖苷酶以前體的形式存在。

芳基硫酸酯酶的作用是水解體內(nèi)的硫酸鹽, 芳基硫酸酯酶B主要水解體內(nèi)的糖胺聚糖(gags), 特別是水解硫酸皮膚素和硫酸軟骨素, 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示其與人芳基硫酸酯酶前體一樣, N端具有信號(hào)肽, 以前體存在。天冬酰胺氨基葡萄糖酶能水解與天冬酰胺殘基相連的N-糖苷鍵(GlcNAc-Asn), 二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示其沒有信號(hào)肽, 表明其以活性形式存在溶酶體中。

鰻弧菌感染后, 泥蚶血細(xì)胞中四種酶表達(dá)量均增加, 表明其在水解細(xì)菌過程中發(fā)揮作用, 溶酶體酶水解作用是血細(xì)胞殺傷和清除細(xì)菌的重要途徑, 與魁蚶血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)研究相一致(Zhou, 2019)。

3.3 整合素

整合素是一種跨膜蛋白, 由α和β兩個(gè)亞基通過非共價(jià)結(jié)合形成二聚體, 介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互識(shí)別和粘附(馬進(jìn), 2004)。在人類研究中發(fā)現(xiàn), 整合素β3有兩種存在形式: 與αIIb形成二聚體以及與αV形成二聚體, αIIbβ3主要表達(dá)于巨核細(xì)胞和血小板上, αVβ3存在于多種細(xì)胞上(姜泓等, 2007)。泥蚶沒有巨核細(xì)胞和血小板, β3應(yīng)以αVβ3形式存在于血細(xì)胞上。整合素β3的天然配體都含有一段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列, 包括纖連蛋白、玻連蛋白和層粘連蛋白等配體, 整合素β3與配體識(shí)別后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程, 使下游激酶發(fā)生磷酸化修飾, 如絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)、磷酸肌醇激酶(Phosphoinositide 3-kinase, PI3K)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase, ERK)磷酸化, 從而發(fā)揮生理學(xué)功能, 如細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移等(Sun, 2016; Zoppi, 2018)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的泥蚶整合素β3序列具有典型的整合素β結(jié)構(gòu)域, 包括胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域(Xiong, 2001), 泥蚶整合素β3具有3個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域, 與人類整合素3保守結(jié)構(gòu)域稍有差異。鰻弧菌刺激后, 血細(xì)胞中整合素β3表達(dá)沒有明顯變化, 暗示泥蚶整合素β3不直接參與鰻弧菌識(shí)別與吞噬, 而Lv等(2019)研究發(fā)現(xiàn)長牡蠣血細(xì)胞中整合素β5參與結(jié)合和吞噬大腸埃希桿菌。

3.4 熱休克蛋白和Toll相互作用蛋白

HSPA9是熱休克蛋白70家族成員之一, HSPA9存在于線粒體, 是線粒體主要蛋白質(zhì)之一, 與細(xì)胞多種生理活動(dòng)密切相關(guān), 如負(fù)責(zé)精確調(diào)控線粒體蛋白的輸入和輸出、線粒體產(chǎn)能、分子伴侶以及應(yīng)激反應(yīng)等(張國彬等, 2009)。鰻弧菌感染后, 泥蚶血細(xì)胞中HSPA9表達(dá)顯著增高, 表明其參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng), 與斑點(diǎn)叉尾鮰研究結(jié)果相一致(Song, 2016)。

Toll相互作用蛋白是一種接頭蛋白, 在天然免疫中發(fā)揮重要作用, 其是Toll樣受體信號(hào)通路的組成部分。未受刺激的泥蚶血細(xì)胞中, Toll相互作用蛋白表達(dá)量較高, 表明其也是一種負(fù)調(diào)控因子, Tollip能下調(diào)MyD88依賴性的TLRS信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng), 使NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性降低, 以避免免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體本身的損傷(陳維英等, 2011)。受鰻弧菌刺激24h后, 泥蚶血細(xì)胞中Tollip表達(dá)量變化不顯著, 鰻弧菌刺激后蝦夷扇貝血細(xì)胞中Tollip表達(dá)量24h時(shí)顯著上升(李若佼, 2015), 而日本鰻鱺感染嗜水氣單胞菌24h后肝臟、脾臟和腎中Tollip表達(dá)量沒有明顯變化(Feng, 2019), 表明Tollip響應(yīng)細(xì)菌感染的表達(dá)模式有種屬差異。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)泥蚶血細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行基因信息注釋和生物信息學(xué)分析, 獲得了7個(gè)免疫相關(guān)基因的蛋白序列, 包括溶酶體酶、整合素、熱休克蛋白和Toll相互作用蛋白, 分析了7個(gè)基因蛋白序列理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu), 鰻弧菌感染后4種溶酶體酶和熱休克蛋白9表達(dá)量顯著升高, 獲得地這些基因序列有利于更深入研究泥蚶的抗病機(jī)理。

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ANALYSIS OF THE STRUCTURE AND EXPRESSION OF IMMUNE-RELATED GENES IN BLOODY CLAMBASED ON HAEMOCYTE TRANSCRIPTOME SEQUENCING

ZHONG Ai-Hua, CHU Zhang-Jie, WANG Wei-Hong, MOU Yi

(School of Fishery, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

The haemocytes of shellfish are directly involved in the phagocytosis and encapsulation of foreign materials. They also play an important role in the process of wound repair and inflammatory response. They are the undertaker of immune defense. RNA sequencing technology was used to study the transcriptome of haemocytes from bloody clam. By sequence assembly, the sequences of α-glucosidase (GAA), α-mannosidase (LAMAN), arylsulfatase B (ASB), asparagine glucosaminase (AGA), integrin β3 subunit (ITB3), heat shock protein 9 (HSPA9) and toll interaction protein (TOLLIP) were obtained. The encoded proteins were obtained by Orfinder. The physical and chemical properties, secondary structure, conserved domain, and tertiary structure were analyzed. The results showed that the secondary structures of the seven proteins contained α-helix, β-fold, and irregular curl. The ITB3 and TOLLIP conserved domains of clam and human are similar. The homology of the tertiary structure and template from Swiss-Model was more than 35% (except TOLLIP). After stimulation by, the expression of GAA, LAMAN, ASB, AGA, and HSPA9 increased significantly, while the expression of ITB3 and Tollip did not change significantly. This study complemented and improved the understanding of immune related genes, and provided important information for further research on the disease resistance mechanism of.

bloody clam; haemocyte; RNA sequencing; immune-related gene

* 浙江省“水產(chǎn)”一流學(xué)科開放課題, 20160012號(hào); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 31700322號(hào)。鐘愛華, 碩士, 講師, E-mail: zhongpe@zjou.edu.cn

2019-12-08,

2020-01-06

S917.4

10.11693/hyhz20191200251