丁玉紅，姚陡奇，郭秀穎

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 皮膚科，吉林 長(zhǎng)春130031)

白藜蘆醇(resveratrol,Res) 是一種廣泛存在的非黃酮類多酚化合物，主要是從葡萄、桑葚、虎杖等提取出來(lái)的，是許多中藥的主要成分[1]，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒以及調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等多種生物學(xué)功能，目前在人體健康領(lǐng)域和動(dòng)物生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用[2]。

心肌梗死、心臟瓣膜病、高血壓等是老年人的常見以及高發(fā)疾病，而心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是這類疾病影響心臟功能的常見病理性改變。目前認(rèn)為MF是由細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常而過(guò)度沉積導(dǎo)致的[3,4]。大量研究證明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活占據(jù)MF的主導(dǎo)地位，其中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生[5]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smads信號(hào)通路也與MF密切相關(guān)[6]。TGF-β1是TGF-β家族中強(qiáng)致纖因子，它可以趨化并誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞分化成肌纖維細(xì)胞，合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)并與細(xì)胞因子或者炎性因子反應(yīng)；也可以直接刺激膠原蛋白等因子的表達(dá)，促進(jìn)ECM的合成并且抑制其降解，進(jìn)而導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積，促使心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[7]。

白藜蘆醇對(duì)心血管疾病有很多保護(hù)作用[8]，但目前尚未明確其抗MF的相關(guān)機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在離體培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞(RDFs)上，觀察Res 對(duì)AngⅡ 刺激RDFs增殖和分化的抑制作用，并探討Res改善纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

白藜蘆醇購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司。大鼠心肌成纖維細(xì)胞系(RDFs)購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所 (ATCC,美國(guó))。胰酶、青霉素鏈霉素雙抗及DMSO購(gòu)自美國(guó)invitrogen 公司。I型膠原蛋白(Collagen I)和Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成公司。血管緊張素Ⅱ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？贵wPCNA、GAPDH購(gòu)自CST公司；抗體a-SMA、TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3和Smad7購(gòu)自abcam公司。BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京碧橙藍(lán)科技有限公司。余為市售分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司； 超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海智成分析儀器制造有限公司；高速低溫離心機(jī)(湖南湘儀公司)；超純水儀購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore 公司；X線膠片(樂凱公司)；電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；PVDF轉(zhuǎn)移膜(GE Healthcare公司，0.42 μm)。

1.3 大鼠心肌成纖維細(xì)胞RDFs的培養(yǎng)

RDFs培養(yǎng)于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(Fibroblast medium,FM)中，含 1 %成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10 %胎牛血清和 100 U/mL 青霉素和鏈霉素。培養(yǎng)箱溫度 37 °C，95 %空氣混合 5% CO2。每 48 小時(shí)更換一次培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

培養(yǎng)RDFs融合度達(dá)到85%-90%，將細(xì)胞的培養(yǎng)基更換成不含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞分為三組：對(duì)照組、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)組和Res組。AngⅡ組:培養(yǎng)基中加入AngⅡ(終濃度為1 μmol/L)，孵育細(xì)胞至24 h；Res組：培養(yǎng)基中同時(shí)加入AngⅡ(終濃度為1 μmol/L)和白藜蘆醇(終濃度為25 μmol/L)，共同孵育細(xì)胞至24 h；對(duì)照組：加入同等體積的PBS，孵育細(xì)胞至24 h。

1.5 大鼠成纖維細(xì)胞RDFs培養(yǎng)基中膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ含量測(cè)定

三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，收集培養(yǎng)基，按照說(shuō)明書，分別用ELISA試劑盒檢測(cè)collagen I和 collagen Ⅲ含量。在酶標(biāo)儀上設(shè)置450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度并計(jì)算最終濃度。

1.6 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)

三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS 洗3 遍，加入200 μl 細(xì)胞裂解液RIPA(含蛋白酶抑制劑)，超聲破碎細(xì)胞，提取蛋白樣品。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h 后，分別加入一抗，PCNA(1∶2 000)、α-SMA (1∶2 000)、TGF-β1(1∶1 000)、TGF-βRⅡ(1∶1 000)、Smad3(1∶1000)、Smad7(1∶1000)和 GADPH(1∶4000)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細(xì)胞RDFs中PCNA的表達(dá)

PCNA作為細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。本研究觀察到，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)RDFs中的PCNA蛋白水平明顯增加 (P<0.05)，提示Ang Ⅱ可誘導(dǎo)RDFs增殖；而給予Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)RDFs中PCNA蛋白水平的增加(P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs增殖，如圖1所示。

圖1 Res對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細(xì)胞RDFs中PCNA的表達(dá)的影響

2.2 Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中α-SMA含量增加

α-SMA是成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，本研究觀察到，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)RDFs中的α-SMA蛋白水平明顯增加 (P<0.05)，提示Ang Ⅱ可誘導(dǎo)RDFs發(fā)生分化；而給予Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)RDFs中α-SMA蛋白水平的增加 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs發(fā)生分化，見圖2。

2.3 Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs培養(yǎng)基中膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ含量增加

肌成纖維細(xì)胞可以分泌合成細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)以膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ為主。本研究觀察到，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)RDFs培養(yǎng)基中的collagen I和 collagen Ⅲ含量明顯增加 (P<0.05)；而Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)RDFs中collagen I和 collagen Ⅲ含量增加 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs分泌膠原，見圖3。

圖2 Res對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細(xì)胞RDFs中α-SMA的表達(dá)的影響

圖3 Res對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細(xì)胞RDFs中膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ含量的表達(dá)的影響

2.4 Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加及Smad7含量降低

TGF-β1/Smads信號(hào)通路與MF 密切相關(guān)。本研究觀察到，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加，降低Smad7含量 (P<0.05)；而給予Res可以明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加，抑制Smad7含量降低 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中TGF-β1/Smads信號(hào)通路的活化，從而抑制纖維化。見圖4。

圖4 Res對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3和Smad7含量的影響

3 討論

心肌纖維化導(dǎo)致的并發(fā)癥已成為心血管疾病死亡的主要原因。心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展與心肌成纖維細(xì)胞增殖、分化和分泌膠原有著緊密的聯(lián)系[9,10]。白藜蘆醇對(duì)心血管疾病有很明顯的保護(hù)作用[8]，但目前尚未明確其抗MF的作用及相關(guān)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用Ang Ⅱ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RDFs 24 h后,RDFs中PCNA和α-SMA蛋白水平增多， TGF-β1、膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ明顯增加，并且TGF-βRⅡ和Smad3蛋白水平增加，Smad7蛋白水平降低，提示Ang Ⅱ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RDFs增殖和分化、促進(jìn)RDFs分泌膠原和活化TGF-β1/Smads信號(hào)通路促進(jìn)纖維化；而給予白藜蘆醇可明顯改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的上述指標(biāo)變化，提示白藜蘆醇可以抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs發(fā)生纖維化。

心肌的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，后者具有平滑肌細(xì)胞和CFs雙重功能，能夠合成細(xì)胞外基質(zhì)，以膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ為主，并與TNF-α、TGF-β1等細(xì)胞因子發(fā)生反應(yīng)，加速心肌纖維化的進(jìn)程，促進(jìn)心肌纖維化的形成[11]。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物[12]。PCNA作為細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn) Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)RDFs中α-SMA和PCNA的蛋白水平增加，抑制膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ的含量，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs增殖和分化，并且抑制纖維化。

TGF-β1是目前已知的最強(qiáng)的促纖維化因子之一。TGF-β1/Smads信號(hào)通路上調(diào)可以促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其分化為心肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)膠原的含量增多，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，促進(jìn)心肌發(fā)生纖維化。以往的研究已經(jīng)證實(shí)了 TGF-β1 與成纖維細(xì)胞[14]或周細(xì)胞[15]膜上的TGFβRⅡ 結(jié)合，形成復(fù)合體，活化 Smad2/3，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，啟動(dòng)膠原合成相關(guān)的基因，產(chǎn)生前體膠原蛋白和纖維合成相關(guān)蛋白，促進(jìn)心肌間質(zhì)的I型和Ⅲ型膠原蛋白的沉積[16]。Smads 蛋白可以分為受體調(diào)節(jié) Smads 蛋白、共同介質(zhì)型 Smads 蛋白和抑制性 Smads 蛋白。Smad2/3 是受體調(diào)節(jié) Smads 蛋白，與受體結(jié)合后，可上調(diào) TGF-β1 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；Smad7 是抑制性 Smads 蛋白，阻止受體調(diào)節(jié) Smads 蛋白磷酸化，從而阻斷 TGF-β1信號(hào)通路效應(yīng)[17]。Smad7抑制TGFβ1信號(hào)通路的作用發(fā)揮在損傷后的早期階段，過(guò)表達(dá)Smad7可抑制TGFβ1介導(dǎo)的纖維化[18]。本研究結(jié)果顯示，Res可以明顯下調(diào)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的TGF-β1含量增加、下調(diào)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的TGF-βRⅡ和Smad3蛋白含量增加、改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的Smad7的蛋白含量的降低，提示Res通過(guò)抑制Ang Ⅱ激活的TGF-β1/Smads信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制纖維化的作用。

綜上所述，Res抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖和分化及纖維化的作用機(jī)制可能與其抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖和分化，下調(diào)I型和Ⅲ型膠原蛋白含量、抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路活化從而抑制纖維化有關(guān)，為臨床解決纖維化等相關(guān)疾病的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。