李昕華，徐曉燕，劉艷華

(長(zhǎng)春市中心醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130051)

在神經(jīng)元缺血損傷中星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)多種途徑起著內(nèi)源性保護(hù)作用[1]，缺血預(yù)處理能調(diào)動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，對(duì)后續(xù)的致死性缺血產(chǎn)生耐受[2,3]。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)對(duì)神經(jīng)元的增殖、凋亡和軸突形成、突觸發(fā)生及突觸的可塑性等許多方面起調(diào)節(jié)作用，對(duì)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元有著很強(qiáng)的保護(hù)作用[4,5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF增加，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取缺血預(yù)處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基制備條件培養(yǎng)基(ACM)，沉默GDNF基因后制備另一種條件培養(yǎng)基，利用不同的ACM孵育缺血預(yù)處理神經(jīng)元，檢測(cè)神經(jīng)元凋亡及p38MAPK、p-p38MAPK的蛋白表達(dá)，探討在缺血預(yù)處理中星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF的腦保護(hù)作用及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar大鼠購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。高糖DMEM 干粉培養(yǎng)基、胎牛血清及馬血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，EGFP表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自武漢晶賽生物技術(shù)公司，AnnexinV-FITC、PI購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，兔抗單克隆p38 MAPK一抗、兔抗單克隆p-p38 MAPK一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 大鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪模型制備

見(jiàn)本課題組前期研究[6,7]。

1.3 制備條件培養(yǎng)基并孵育神經(jīng)元后測(cè)定神經(jīng)元凋亡

取正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，離心15 min后取上清，即為ACM1；前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[8]，OGD預(yù)處理及再缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF在再灌注24 h表達(dá)最高，取這一時(shí)間點(diǎn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，離心15 min后取上清，即為ACM2；利用EGFP表達(dá)質(zhì)粒沉默GDNF基因，轉(zhuǎn)染的星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注24 h后GDNF沉默效果最佳，選取此時(shí)的培養(yǎng)基，離心15 min后取上清，即為ACM3。將神經(jīng)元分為對(duì)照組、預(yù)處理組、預(yù)處理+缺血組、缺血組四組，分別用3種條件培養(yǎng)基孵育4組神經(jīng)元，24小時(shí)后AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定神經(jīng)元凋亡率。將神經(jīng)元用0.125%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，取1 ml細(xì)胞懸液，離心棄上清后加入Binding Buffer 500 μl重懸，加入5 μl AnnexinV-FITC，混勻后加入5 μl PI ，反應(yīng)15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Cellquest軟件分析結(jié)果，計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。

1.4 神經(jīng)元 p38MAPK、p-p38MAPK的檢測(cè)

Western Blot法檢測(cè)神經(jīng)元p38MAPK、p-p38MAPK的表達(dá)，上述四組神經(jīng)元用3種條件培養(yǎng)基孵育24小時(shí)后用Western blot法檢測(cè)。將神經(jīng)元用PBS洗滌2次，裂解細(xì)胞后收集上清蛋白質(zhì)，用考馬斯亮蘭G250試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠，將蛋白加入加樣槽后電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，將第一抗體按1∶800稀釋后加入放置NC膜的封閉袋中4℃靜置過(guò)夜。將第二抗體按1∶1000稀釋后放入封閉袋中，37℃孵育1 h。按照北京中杉金橋生物試劑公司的DAB顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果，進(jìn)行吸光度分析，計(jì)算p38MAPK、p-p38MAPK與GAPDH光密度的比值，得出蛋白質(zhì)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)元凋亡率檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組和預(yù)處理組均可見(jiàn)極少量的壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，加入3種不同的ACM后凋亡率變化不明顯(P>0.05)。預(yù)處理+缺血組和缺血組神經(jīng)元凋亡率明顯高于正常對(duì)照組和預(yù)處理組(P<0.05)，加入ACM2后凋亡率較ACM1和ACM3兩組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 AnnexinV-FITC/PI FCM檢測(cè)神經(jīng)元凋亡率(n=36，%)

圖1 ACM2預(yù)處理+缺血組FCM，可見(jiàn)神經(jīng)元凋亡和壞死，早期神經(jīng)元凋亡率較ACM3組低

2.2 各組神經(jīng)元 p38MAPK蛋白表達(dá)

每組神經(jīng)元的p38MAPK蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 神經(jīng)元p38MAPK表達(dá)(n=36，%)

2.3 各組神經(jīng)元p- p38MAPK的蛋白表達(dá)

預(yù)處理+缺血組及缺血組p- p38MAPK的蛋白表達(dá)均明顯高于照組和預(yù)處理組，在任何一種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下都是如此表達(dá)趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。預(yù)處理+缺血組p- p38MAPK的蛋白表達(dá)均較缺血組低，在任何一種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下都是如此表達(dá)趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加入ACM2組的p- p38MAPK蛋白表達(dá)低于ACM1和ACM3兩組，ACM3組的表達(dá)較ACM1組稍高，但統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3，圖2。

表3 神經(jīng)元p-p38MAPK表達(dá)(n=36，%)

圖2 ACM2孵育后各組神經(jīng)元p-p38MAPK表達(dá)

3 討論

缺血缺氧既可引起神經(jīng)細(xì)胞壞死，也可造成神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡[9]。本實(shí)驗(yàn)利用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記FCM檢測(cè)凋亡率，結(jié)果表明神經(jīng)元氧糖剝奪后發(fā)生壞死及凋亡，缺血缺氧通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及壞死從而產(chǎn)生腦損傷，而神經(jīng)元壞死不可逆，因此，抗神經(jīng)元凋亡在防治缺血性腦損傷可能發(fā)揮重要作用。ACM2能顯著減少缺血神經(jīng)元的凋亡，說(shuō)明預(yù)處理使星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF通過(guò)減少神經(jīng)元凋亡發(fā)揮腦保護(hù)作用。

絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)包括ERK通路、 p38MAPK通路、c-jun氨基末端激酶通路等。p38 MAPKs因通過(guò)細(xì)胞外應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)因子刺激而激活，故被稱為應(yīng)激激活蛋白激酶，p38 MAPK信號(hào)通路與腦缺血再灌注損傷及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病有密切關(guān)系[10,11]。p38 MAPK經(jīng)過(guò)典型的3級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)磷酸化激活p38(p-p38MAPK)，隨即作用于其下游因子或蛋白：tau蛋白、NFAT、ATF-2/6、PRAK等[11]，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理、生理過(guò)程。組織或細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)可見(jiàn)多種細(xì)胞因子參與，而細(xì)胞因子的產(chǎn)生與p38MAPK激活密切相關(guān)，再灌注產(chǎn)生的氧化物能激活p38MAPK，進(jìn)而增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，造成組織或細(xì)胞缺血再灌注損傷，p38MAPK抑制對(duì)缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用[12]。研究顯示，p38MAPK信號(hào)通路在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中起重要調(diào)控作用，激活p38MAPK信號(hào)通路可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，抑制p38MAPK信號(hào)通路可抑制神經(jīng)元凋亡，減輕腦損傷[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組、預(yù)處理組、預(yù)處理+缺血組及缺血組中神經(jīng)元p38MAPK均無(wú)變化，在任何一種培養(yǎng)基中的表達(dá)也均恒定，但在預(yù)處理+缺血組及缺血組p- 38MAPK的蛋白表達(dá)均增多，說(shuō)明在神經(jīng)元缺血及缺血預(yù)處理后p38MAPK通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化為p-p38MAPK從而參與細(xì)胞凋亡。在任何一種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下預(yù)處理+缺血組p-p38MAPK均較缺血組低，提示缺血預(yù)處理通過(guò)激活p38MAPK信號(hào)通路減輕神經(jīng)元凋亡發(fā)揮腦保護(hù)作用。加入ACM2組的p-p38MAPK蛋白表達(dá)低于ACM1和ACM3兩組，說(shuō)明缺血預(yù)處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF抑制p38MAPK信號(hào)通路的激活從而減少神經(jīng)元凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用。