井鴻雁，黃 斌，王 微

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033)

骨肉瘤是臨床上最常見的骨組織原發(fā)惡性腫瘤之一，約占全部骨腫瘤的20%，也是兒童和青少年的常見惡性腫瘤。骨肉瘤具有進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)的臨床特點(diǎn)，通常以疼痛、腫塊、跛行等為主要表現(xiàn)，目前針對骨肉瘤的治療以手術(shù)和化療為主[1]，患者的預(yù)后與其臨床分期具有密切的關(guān)系，非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的術(shù)后5年存活率為50%-70%，而轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的術(shù)后5年存活率僅為15%-30%[2]，因此，提高對早期骨肉瘤的診斷效率是改善患者預(yù)后的重要手段。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，針對骨肉瘤的基因?qū)用嫜芯恳阎饾u從蛋白質(zhì)編碼基因拓展至非蛋白質(zhì)編碼基因，長鏈非編碼RNA(lncRNA)主要功能是對染色體發(fā)揮修飾作用，并在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面發(fā)揮調(diào)控作用[3]，能夠直接參與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程[4]。學(xué)者們已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA通過復(fù)雜的機(jī)制參與了骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展，并介導(dǎo)其侵襲轉(zhuǎn)移過程[5]。近年來，一些研究者開始嘗試應(yīng)用外周血lncRNA表達(dá)水平作為診斷骨組織惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物，取得了一定的進(jìn)展[6]。尿路上皮癌胚抗原1(UCA1)是一種在胚胎組織中普遍表達(dá)的lncRNA，而在成人僅有心臟和脾臟組織有少量表達(dá)，在多種腫瘤組織中均可觀察到lncRNA UCA1的過表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移行為有關(guān)，本文針對骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1表達(dá)及臨床意義進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料

連續(xù)選取2017年6月-2019年6月在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院住院治療、符合本研究入選標(biāo)準(zhǔn)的194例骨腫瘤患者作為病例組，其中，118例骨肉瘤患者為惡性組，76例良性骨腫瘤患者為良性組，選取同期100例接受體檢者作為對照組，對三組研究對象的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量進(jìn)行檢測和分析，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn) 病例組患者均符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)制訂的《骨腫瘤臨床指南(2017年版)》中的骨肉瘤和良性骨腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，均經(jīng)術(shù)前穿刺活檢或術(shù)后病理檢查確診。所有患者均為初診初治病例，臨床資料完整。對照組研究對象均經(jīng)臨床檢查排除骨腫瘤。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 合并有其它部位原發(fā)惡性腫瘤、骨及重要器官畸形、心肺肝腎等重要器官功能不全、血液系統(tǒng)疾病、心腦血管卒中者；入院前已接受抗腫瘤治療的患者；妊娠期或哺乳期患者。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1一般資料調(diào)查 對所有研究對象的年齡和性別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查；對惡性組患者臨床分期、腫瘤位置、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查；對良性組患者的腫瘤種類、腫瘤位置進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查。

1.2.2血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量檢測 病例組于入院次日采集空腹外周靜脈血樣本4 ml，對照組研究對象于體檢當(dāng)日采集空腹外周靜脈血樣本4 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理后，血樣經(jīng)3 000 r/min離心15 min后以微量取樣器吸取血漿，移入1.5 ml EP管置于-20℃冰箱中保存待測。檢測時(shí)將血漿樣品置于冰上融化，吸取250 μl血漿樣品，以Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總RNA，以20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以U6為內(nèi)參、采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-PCR)檢測lncRNA UCA1相對表達(dá)量，引物序列及反應(yīng)體系見表1、表2。反應(yīng)程序?yàn)椋浩鹗寄０遄冃?5℃ 1 min，PCR模板變性95℃ 20 s，退火、延伸61℃ 31 s，連續(xù)反應(yīng)45次。計(jì)算內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的循環(huán)閾值(Ct值)，以2-ΔΔCt計(jì)算lncRNA UCA1相對表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次取平均值作為最終測量值。

表1 q-PCR反應(yīng)引物序列

表2 q-PCR反應(yīng)體系

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 三組研究對象的一般資料情況

三組研究對象在年齡、性別構(gòu)成方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，惡性組與良性組患者在腫瘤位置、腫瘤大小方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 三組研究對象的一般資料情況對比

2.2 三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量的比較

三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，惡性組患者的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量高于良性組或?qū)φ战M，良性組患者的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量高于對照組，各組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.3 不同臨床特征骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量的對比

在惡性組中，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量高于臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期的患者，出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量高于未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小患者的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表4 三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量的比較

表5 不同臨床特征骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量的對比

2.4 血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量診斷骨肉瘤的價(jià)值分析

血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量在骨肉瘤診斷、骨肉瘤與良性骨腫瘤鑒別診斷、Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤診斷及骨肉瘤伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷中的AUC分別為0.854、0.876、0.711、0.719，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在Cutoff值下，血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量在骨肉瘤診斷、骨肉瘤與良性骨腫瘤鑒別診斷中的靈敏度分別為0.727、0.661，特異度均達(dá)到了1.000，在Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤診斷、骨肉瘤伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷中的靈敏度分別為0.852、0.870，特異度分別為0.626、0.568。見表6、圖1。

表6 血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量診斷骨腫瘤及骨肉瘤的ROC曲線分析

注：(A)診斷骨肉瘤的ROC曲線分析;(B)鑒別診斷骨肉瘤與良性骨腫瘤的ROC曲線;(C)診斷Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤的ROC曲線;(D)診斷骨肉瘤伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與健康人群相比，骨腫瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量較高，特別是骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量出現(xiàn)了顯著上調(diào)，血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量能夠作為骨腫瘤診斷和良性骨腫瘤與骨肉瘤鑒別診斷的輔助指標(biāo)。近年來，僅有一項(xiàng)研究[8]針對骨肉瘤血循環(huán)中的lncRNA UCA1表達(dá)量進(jìn)行了分析，該研究結(jié)果顯示，骨肉瘤患者的外周血lncRNA UCA1表達(dá)上調(diào)，在診斷骨肉瘤中的AUC為0.831，這與本研究結(jié)果基本一致，且該研究結(jié)果還顯示，高表達(dá)水平的lncRNA UCA1與較低的總生存率和無病生存率相關(guān)，是預(yù)測患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)，但是，該研究選取的檢測材料為血清樣本，而且對照組僅為健康人群，與本研究設(shè)計(jì)方案存在一定的差異。筆者認(rèn)為，骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1過表達(dá)有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞凋亡過程中，其細(xì)胞漿物質(zhì)通過局部血液循環(huán)進(jìn)入體循環(huán)。相關(guān)研究[9]已證實(shí)，lncRNA UCA1在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中存在明顯的表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床特征密切相關(guān)，在敲除抑制lncRNA UCA1基因后，骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移受到抑制，細(xì)胞凋亡加快。通過細(xì)胞定位和組織表達(dá)譜分析，UCA1基因主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞漿，其表達(dá)水平要明顯高于癌旁組織，雖然腫瘤患者體液中的lncRNA UCA1表達(dá)水平一般遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于腫瘤組織，但仍然可觀察到患者體液樣本中l(wèi)ncRNA UCA1表達(dá)水平的異常上升，比較典型的例子是，相關(guān)研究[10]已證實(shí)，膀胱癌患者尿液中的lncRNA UCA1表達(dá)水平可用于膀胱癌的診斷，不僅具有較高的敏感性和特異性，而且結(jié)果穩(wěn)定性也較好；此外，針對肝細(xì)胞癌、食管鱗癌患者血清lncRNA UCA1表達(dá)的研究[11,12]也得出相似的結(jié)論。因此，針對具有骨腫瘤癥狀的患者，在應(yīng)用影像學(xué)手段的同時(shí)，針對其外周血lncRNA UCA1表達(dá)量進(jìn)行檢測，能夠?yàn)榧膊〉蔫b別診斷提供一種無創(chuàng)性的參考指標(biāo)，從而為考慮是否采用進(jìn)一步的有創(chuàng)診斷手段提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期及出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量上調(diào)更加顯著，其水平可輔助診斷骨肉瘤臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，這提示了lncRNA UCA1的過表達(dá)可能與骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)，血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量能夠作為預(yù)測骨肉瘤疾病進(jìn)展程度的輔助指標(biāo)。近年來，研究者針對lncRNA UCA1的促癌機(jī)制進(jìn)行了大量研究[13,14]，發(fā)現(xiàn)了lncRNA UCA1在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥等多種惡性表型方面均發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，作為一種競爭性內(nèi)源RNA，lncRNA UCA1主要通過作用于染色質(zhì)修飾體、對染色體成環(huán)進(jìn)行調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)化為微小RNA(miRNA)、吸附miRNA等機(jī)制，在表觀遺傳學(xué)水平上對靶基因發(fā)揮間接調(diào)節(jié)作用，從而參與了腫瘤病理過程的調(diào)控。通過對非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、咽鱗狀細(xì)胞癌等的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究[15-17]，研究者已發(fā)現(xiàn)了lncRNA UCA1可對miRNA-185-5p、miRNA-582-5p、miRNA-143、p21等下游基因和β-Catenin等分子通路發(fā)揮調(diào)控作用從而發(fā)揮促癌作用，主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡并上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶、Ki67等侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。此外，進(jìn)一步的研究[18]還證實(shí)，外源性加入lncRNA UCA1可促進(jìn)癌細(xì)胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量的提升，增強(qiáng)癌細(xì)胞的生存及運(yùn)動(dòng)能力，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。而在針對骨肉瘤的研究[19-21]中，研究者也發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織可通過表達(dá)C-C基序趨化因子配體18、低氧誘導(dǎo)因子-1α等誘導(dǎo)lncRNA UCA1的表達(dá)，而lncRNA UCA1能夠通過調(diào)控miRNA-582及影響PI3K/AKT/mTOR、PTEN/AKT、Wnt/β-catenin等信號通路，促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，最終促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。由于骨肉瘤具有早期轉(zhuǎn)移快、化療易耐藥的特點(diǎn)，故中晚期或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后通常較差，因此，臨床醫(yī)生應(yīng)充分發(fā)揮lncRNA UCA1等遺傳學(xué)指標(biāo)的作用，努力提高對早期骨肉瘤的診斷效率，對遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等進(jìn)行充分的預(yù)測，從而達(dá)到改善患者預(yù)后的目的。

值得提出的是，限于研究時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，本文未對患者的術(shù)后生存期進(jìn)行隨訪，也未將lncRNA UCA1與其它生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行橫向?qū)Ρ?，這是本研究的不足之處，將在后續(xù)的研究中予以補(bǔ)充。

綜上所述，骨腫瘤患者可出現(xiàn)血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量的上調(diào)，特別是骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1過表達(dá)更加明顯，血漿lncRNA UCA1相對表達(dá)量與骨肉瘤的疾病進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為骨肉瘤診斷及病情評價(jià)的輔助指標(biāo)。