馬舒婷，謝 風(fēng)，劉金華，李 威

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

纖維蛋白原γ鏈(FGG)是纖維蛋白原(FG)的一種組分,DNA分析顯示是10.5 kb中存在10個外顯子和9個內(nèi)含子[1]的片段。人血漿中FG主要由肝臟產(chǎn)生，由α，β以及γ三條多肽鏈以二硫鍵為連接方式組成[2]，三條多肽鏈分別由FGA、FGB以及FGG基因編碼。FGG可在凝血過程中發(fā)揮功能，同時在早期創(chuàng)傷性修復(fù)中具有穩(wěn)定病灶和引導(dǎo)上皮細(xì)胞遷移的作用。本研究旨在探究FGG在結(jié)直腸癌和其癌旁組織中的表達(dá)情況以及差異性，探討FGG與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展間的關(guān)系，進(jìn)而為臨床提供診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

23例結(jié)直腸癌患者(均被吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院確診),手術(shù)中切除的新鮮組織作為研究對象，同時留取與其配對的癌旁組織(距離取材的癌組織10 cm以上)。以上取材離體后液氮速凍，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

測序級胰蛋白酶、DNA酶、RNA酶、考馬斯亮藍(lán)-G250均購于西格瑪(美國)公司，蛋白定量試劑盒、IAA(購于Bio-Rad公司)，DTT，F(xiàn)A，尿素，TMED。液相色譜分析儀(Agilent公司)，LTQ XL離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Fisher公司)，UV-2000型分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1總蛋白的提取、蛋白濃度測定 將凍存的待測組織樣本取出，充分研磨至勻漿。在4℃，12 000 g條件下離心，1 h，留取上清液待用?？捡R斯亮藍(lán)染色后用UV-2000型分光光度計于590 nm處進(jìn)行比色，從而計算出樣本蛋白的濃度。

1.3.2組織蛋白水解多肽混合物的制備 將樣本從冰箱中取出置于室溫下平衡后，為降低尿素在樣本中的濃度，應(yīng)用NH4HCO3稀釋。加入一定量DTT后充分混勻，使終濃度調(diào)至20 mmol/L，置56℃，避光1 h。待上述操作完成后降至室溫，取1 mol/L IAM 適量，使終濃度調(diào)至50 mmol/L，置室溫，避光30 min。測序級胰酶按胰酶與蛋白質(zhì)1:50的比例加入，而后置于37℃水浴箱中，過夜，酶切產(chǎn)物(真空抽干)，保存于-80℃條件下。

1.3.3液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析 待測樣本用FA溶解后取50 μg上樣，洗脫的多肽用LTQXL質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，選取合適核質(zhì)比范圍，以數(shù)據(jù)依賴的方式進(jìn)行質(zhì)譜掃描。所得質(zhì)譜圖應(yīng)用Bio works3.3.1SP1軟件進(jìn)行分析。

1.3.4Western Blot 該方法驗證目的蛋白FGG在癌組織以及癌旁組織中的表達(dá)情況。所用FGG單克隆抗體為ABGENT公司(美國)，內(nèi)參抗體：GAPDH。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)果分析

配對樣本中蛋白質(zhì)譜圖數(shù)差值≥72，并且比值≥1時，可以說蛋白質(zhì)豐度有差異。按此標(biāo)準(zhǔn)，得出結(jié)直腸癌組織與其癌旁組織的差異蛋白44個，其中21個表達(dá)上調(diào)，23個表達(dá)下調(diào)。FGG質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 FGG質(zhì)譜圖

2.2 Western blot

用Western blot試驗印證了FGG在結(jié)直腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示FGG在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平明顯高于與其配對的癌旁組織，如圖2。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率在近幾年里居高不下，與其他一些癌癥相似，發(fā)病具有隱匿性，一經(jīng)確診已接近中晚期。因此，尋找到可以作為該病病情監(jiān)測以及療效預(yù)測的腫瘤標(biāo)志物成為了目前亟待解決的問題，進(jìn)而達(dá)到提高生存率以及有效治療的目的。本文通過對癌組織以及癌旁組織中蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析比對，從而為臨床診斷提供新的腫瘤標(biāo)志物。Garcia[3]等人通過體外證明，腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生FG。Zhang Xiang[4]等人證實，F(xiàn)GG在原發(fā)性肝癌組織中表達(dá)較相應(yīng)的癌旁組織比較明顯增加。細(xì)胞內(nèi)FGG的表達(dá)上調(diào)與血管侵犯增加、衛(wèi)星結(jié)節(jié)增多、TNM分期加重顯著相關(guān)，F(xiàn)GG表達(dá)增強(qiáng)的肝癌患者復(fù)發(fā)率較高。纖維蛋白原在凝血、纖維蛋白溶解、細(xì)胞和基質(zhì)的相互作用、炎癥和傷口愈合中起著重要的作用[5]。許多研究表明，在惡性腫瘤患者中高纖維蛋白原血癥可以作為預(yù)后因子[6]，并且與腫瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移以及血管生成有關(guān)[7-9]。Yokoyama[10]等人發(fā)現(xiàn)FGG的C末端區(qū)域作為纖維蛋白原的主要整合素結(jié)合位點參與血栓形成、血管生成和炎癥過程。Mark Bloomston[11]等人研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中FGG過表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)、蛋白組學(xué)以及血清酶學(xué)等方法的驗證，其被視為潛在的腫瘤標(biāo)志物[12]。KinoshitaA[13]等人研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌中FGG的mRNA水平增高，并且血漿纖維蛋白原水平隨著臨床分期的增加而增加。有學(xué)者通過定量蛋白組學(xué)以及MALDI-TOF MS的研究表明，F(xiàn)GG與子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，可能成為該病診斷的標(biāo)志物之一[14]。

圖2 結(jié)直腸癌及癌周組織FGG免疫印跡圖

本實驗研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以及Western blot技術(shù)，驗證了FGG在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁的組織。綜上，F(xiàn)GG可以作為結(jié)直腸癌篩查的早期標(biāo)志物之一，從而提高該病的診斷和治療效果。