李炯，顧海濤

1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院乳腺外科，重慶 401120；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普通外科，重慶 400010

近些年國內(nèi)超聲分子顯像技術(shù)發(fā)展迅猛， 靶向超聲造影劑的設計及制備逐步成為研究主流[1]。 雖然靶向超聲造影劑目前仍然在臨床前實驗的階段， 但是從國內(nèi)外研究成果來看，已經(jīng)初步展現(xiàn)出其應用價值。 它能夠在療效監(jiān)測、 癌癥鑒別以及作為基因和藥物載體介導癌癥靶向治療等方面發(fā)揮重要作用[2-3]。 該研究通過制備出靶向載多西紫杉醇超聲微泡， 探討其在體外的乳腺癌MCF-7 細胞上的尋靶能力及對其增殖及凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

NB 培養(yǎng)基；DSPC；DPPE、DPPA；Docetaxel； 熒光染料DiI；PI 染液；基質(zhì)膠；銀汞膠囊調(diào)合器。

1.2 實驗方法

①細胞培養(yǎng)：在適宜條件的浮箱中培養(yǎng)乳腺癌MCF-7 細胞。

②確定多西紫杉醇藥物濃度及計算細胞增殖抑制率。

③細胞分組及處理 （共分6 組：C、LDLM、Doc、PLM+US、Doc+US、LDLM+US）。

④使用MTT 法檢測對乳腺癌MCF-7 細胞增殖的影響，乳腺癌MCF-7 細胞增殖抑制率（%）=[（A 對照組－A 實驗組）/A 對照組]× 100%。

⑤使用Annexin V-FITC 檢測細胞凋亡。

⑥檢測并分析細胞周期分布。

⑦細胞侵襲實驗。

1.3 統(tǒng)計方法

應用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析, 計量資料用（±s）表示,組間比較行t檢驗。 在數(shù)據(jù)錄入之后進行定量或定性的處理， 采用離散或連續(xù)類型方式實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的錄入，針對定性的數(shù)據(jù)不應用分類處理。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

乳腺癌MCF-7 細胞的增殖抑制率與多西紫杉醇藥物濃度與作用時間成正相關(guān),見表1。

表1 不同濃度多西紫杉醇乳腺癌細胞NCF-7 的增殖抑制Table 1 NCF-7 proliferation inhibition of breast cancer cells with different concentrations of docetaxel（±s）

表1 不同濃度多西紫杉醇乳腺癌細胞NCF-7 的增殖抑制Table 1 NCF-7 proliferation inhibition of breast cancer cells with different concentrations of docetaxel（±s）

多西紫杉醇藥物濃度（mol/L）空白對照組不同時間點的增殖抑制率24 h 48 h 72 h 0 0 0 5×10-7 1×10-7 5×10-8 1×10-8 5×10-9 1×10-9 5×10-10 1×10-10 0.916±0.006 0.811±0.005 0.713±0.006 0.636±0.007 0.560±0.004 0.568±0.005 0.359±0.008 0.327±0.023 0.917±0.006 0.850±0.004 0.801±0.004 0.725±0.005 0.731±0.006 0.644±0.004 0.496±0.006 0.399±0.008 0.959±0.005 0.956±0.005 0.858±0.006 0.792±0.005 0.785±0.003 0.712±0.004 0.507±0.004 0.489±0.005

乳腺癌細胞MCF-7 的增殖抑制與作用時間成正相關(guān)，其中LDLM+US 組抑制率高于各組,見表2。

表2 各組不同時間點對乳腺癌細胞MCF-7 的增殖抑制率[（±s），%]Table 2 Inhibition rate of breast cancer cell MCF-7 at different time points in each group[（±s），%]

表2 各組不同時間點對乳腺癌細胞MCF-7 的增殖抑制率[（±s），%]Table 2 Inhibition rate of breast cancer cell MCF-7 at different time points in each group[（±s），%]

組別 24 h 48 h 72 h C PLM+US LDLM Doc Doc+US LDLM+US 0 0 0 0.120 1±0.003 7 0.178 6±0.001 0 0.223 8±0.003 2 0.299 3±0.003 4 0.402 4±0.001 9 0.513 4±0.003 9 0.499 8±0.001 8 0.634 5±0.001 8 0.699 8±0.004 7 0.752 3±0.002 9 0.812 5±0.002 0 0.903 6±0.003 6 0.933 6±0.001 5 0.965 4±0.001 8 0.987 2±0.001 5

Annexin V-FITC 熒光染色聯(lián)合流式細胞儀檢測結(jié)果顯示LDLM+US 組細胞凋亡率最高,見表3 。

表3 Annexin V-FITC 熒光染色聯(lián)合流式細胞術(shù)檢測乳腺癌細胞MCF-7 的凋亡率[（±s），%]Table 3 Annexin V-FITC fluorescence staining combined with flow cytometry to detect the apoptosis rate of breast cancer cell MCF-7[（±s），%]

表3 Annexin V-FITC 熒光染色聯(lián)合流式細胞術(shù)檢測乳腺癌細胞MCF-7 的凋亡率[（±s），%]Table 3 Annexin V-FITC fluorescence staining combined with flow cytometry to detect the apoptosis rate of breast cancer cell MCF-7[（±s），%]

組別組別C PLM+US LDLM Doc Doc+US LDLM+US F 值P 值2.866±0.203 8.023±0.258 11.236±1.365 17.568±1.075 29.605±3.665 45.558±8.455 69.591 0.000

細胞周期檢測結(jié)果各處理組G2/M 期細胞比例有不同程度的增高，LDLM+US 組G0/G1 期細胞比例減少最明顯，G2/M 期細胞比例升高最明顯；Doc+US 組G2/M 期細胞比例也明顯增高，見表4 。

表4 各組乳腺癌MCF-7 細胞的周期分布[（±s），%]Table 4 Cycle distribution of breast cancer MCF-7 cells in each group[（±s），%]

表4 各組乳腺癌MCF-7 細胞的周期分布[（±s），%]Table 4 Cycle distribution of breast cancer MCF-7 cells in each group[（±s），%]

組別 G0/G1 S G2/M C LDLM+US LDLM Doc Doc+US PLM+US F 值P 值60.62±1.73 0.79±0.27 14.54±0.42 10.60±0.96 11.73±0.85 8.70±1.99 1035.72 0.000 32.38±1.56 8.69±0.30 51.11±0.69 47.01±4.55 32.60±2.49 25.83±0.51 186.14 0.000 6.88±0.21 90.52±0.48 34.42±0.90 42.40±5.39 58.77±4.21 25.32±1.92 390.68 0.000

Transwell 法檢測轉(zhuǎn)染后對乳腺癌MCF-7 細胞侵襲力的影響: 各組經(jīng)過相應處理的MCF-7 細胞穿過transwell上下室之間聚碳酸酯膜的結(jié)果如下，對照組及PLM+US 組穿過室膜的細胞數(shù)量較多，而Doc+US 組和LDLM+US 組穿過的細胞數(shù)量較少，其中LDLM+US 組穿過的細胞數(shù)最少。兩組與其他組相比, 差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.01），而LDLM+US 組所侵襲細胞數(shù)量最低（P<0.05）與Doc+US 組相比。

3 討論

多西紫杉醇是目前國內(nèi)比較常用的抗癌藥物， 其藥物原理不僅可以抑制微管解聚， 更可以促進微管的蛋白裝配，進而抑制腫瘤細胞的有絲分裂，因此該實驗選擇多西紫杉醇載入微泡[3-4]。 乳腺癌MCF-7 細胞因其培養(yǎng)方法相對簡單，通常作為細胞實驗常用的細胞株，且培養(yǎng)方法相對比較簡單易操作。 體細胞的增值失調(diào)與死亡抑制是腫瘤發(fā)生的兩大關(guān)鍵因素。 因此，抑制腫瘤細胞繁殖與誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的主要方向之一， 同時抑制腫瘤細胞的繁殖與凋亡誘導作用的強弱也成為評價抗腫瘤藥物療效的重要標準[5-6]。 該實驗采用MTT 法研究了8個不同濃度組的多西紫杉醇對乳腺癌MCF-7 細胞的增殖抑制作用， 其結(jié)果顯示該乳腺癌細胞的活性與藥物的作用時間和藥物濃度成正相關(guān)， 且在作用24 h 時1×10-9mol/L 以上濃度組的增殖抑制率均高于50%，從而確定了多西紫杉醇干預濃度為1×10-9mol/L 為實驗基礎(chǔ)濃度。 通過Annexin VFITC 檢測的各組細胞凋亡率結(jié)果顯示：對照組最低 （2.866±0.203），LDLM+US 組的細胞凋亡率最高（45.558±8.455）， Doc+US（29.605±3.665 ） 組、Doc（17.568±1.075）組次之。流式細胞儀檢測和電鏡觀察的結(jié)果基本一致，均表明了LDLM+US 組的促凋亡作用最強。 MTT 法檢測干預因素對乳腺癌MCF-7 細胞增殖的影響。 結(jié)果顯示LDLM+US 組24、48、72 h （0.933 6±0.001 5）；（0.965 4±0.001 8）；（0.987 2±0.001 5）的細胞增殖抑制率明顯高于其他各組，其原因主要在于超聲微泡的作用，使癌細胞膜的空隙變大， 提高了其通透性， 使藥物方便進入細胞內(nèi)部，從而起到關(guān)鍵抑制作用。 單純載藥微泡組對腫瘤細胞也有增殖抑制作用， 說明微泡所載多西紫杉醇仍能保持原有的抗癌活性，但該組抑制率低于單純藥物組，考慮其可能的原因為載藥微泡未受到超聲波的輻照， 自身破裂緩慢，包裹于磷脂外殼中的藥物無法充分釋放，使藥物濃度降低；PLM+US 組的細胞增殖抑制率低，說明空化效應、聲孔效應等使細胞表面產(chǎn)生的空隙是短暫的、可逆的，未對腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生根本的影響；Doc+US （0.7523±0.002 9） 組的增殖抑制作用也較明顯， 且強于Doc（0.499 8±0.001 8）組，說明超聲波本身具有的空化效應、聲孔效應等促進了藥物的吸收， 提高了療效。 在2018 年曾烏查等學者[7-8]發(fā)表一篇《西紫杉醇血藥濃度監(jiān)測在乳腺癌化療中的臨床應用》中，其載藥微泡+超聲組24、48、72 h 的數(shù)據(jù)分別為：（0.896 6±0.004 7）；（0.863 4±0.003 5）；（0.895 4±0.002 8）的細胞增殖抑制率明顯高于其他組，該實驗載藥微泡+超聲組24、48、72 h （0.933 6±0.001 5）；（0.965 4±0.001 8）；（0.987 2±0.001 5），通過對比，該實驗結(jié)果略高于其數(shù)據(jù)，分析原因：極有可能是該實驗在浮箱中培養(yǎng)乳腺癌MCF-7 細胞時，由于溫度略高于實驗正常溫度，固始MCF-7 細胞存活率上升，導致實驗數(shù)據(jù)偏高。 其他實驗組均與該實驗基本一致。

該實驗證實了LDLM 聯(lián)合 UTMD 對乳腺癌細胞MCF-7 具有明顯的增殖抑制和凋亡促進作用， 為后續(xù)進一步從蛋白、 基因?qū)用嫣剿髌渥饔玫臋C制奠定了重要的基礎(chǔ)，提供了依據(jù)。