白永宏，趙贊延，王亞潔，李金憶，趙 鋒，陳國梁，3

（1.延安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西延安716000；2.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000；3.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西延安716000）

紅棗（Zizyphus jujube Mill）屬于鼠李科棗屬植物，為我國獨(dú)有樹種，至今已有超過3 000 a 的栽培歷史[1]。紅棗富含多種礦物質(zhì)元素，營養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，是百果之王，深受廣大消費(fèi)者青睞。然而，棗成熟期短而且集中，又極不耐貯運(yùn)，產(chǎn)區(qū)常常出現(xiàn)成批鮮棗腐爛的情況。在自然狀態(tài)下，鮮棗采收后不易保鮮、不耐貯藏，果肉很快軟化變褐，常溫下容易代謝失常、腐爛和失水，常常會(huì)出現(xiàn)表面皺縮、果肉組織壞死、積累大量的乙醇等有害物質(zhì)，棗果實(shí)的Vc 幾乎全被破壞，大大降低了棗果的營養(yǎng)價(jià)值，縮短了鮮棗市場的貨架期[2]，極大地限制了我國紅棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本試驗(yàn)研究了狗頭棗果實(shí)在棗果實(shí)生長過程中超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化氫酶（CAT）3 種保護(hù)酶活性，探討這3 種酶在棗果實(shí)成熟軟化中的作用及其相互關(guān)系，以期找到影響棗果實(shí)成熟軟化的關(guān)鍵酶類，掌握相關(guān)酶對(duì)棗果實(shí)生長發(fā)育、成熟軟化等機(jī)制的作用及規(guī)律，進(jìn)一步闡明棗果實(shí)成熟軟化與衰老的酶學(xué)調(diào)控機(jī)制，更好地控制棗果實(shí)成熟軟化進(jìn)程，提高耐貯性，為改善果實(shí)品質(zhì)和完善貯藏保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用狗頭棗果實(shí)采自延安市寶塔區(qū)石家畔村。2018 年8 月5 日至9 月19 日每15 d 采樣一次，9 月20 日至10 月10 日每7 d 采樣一次。采樣方法：隨機(jī)采摘成熟度一致、大小均勻、無機(jī)械損傷和病蟲害的狗頭棗果實(shí)，用清水沖洗，當(dāng)天用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

對(duì)狗頭棗果實(shí)樣品進(jìn)行預(yù)處理：隨機(jī)從超低溫冰箱中取出每個(gè)時(shí)期的狗頭棗果實(shí)各10 顆，分時(shí)期處理，分別去皮去核切成小塊，混勻備用。

1.2.1 粗酶液的制備

1.2.1.1 SOD、CAT 粗酶液的制備 參考田昕等[3]的方法進(jìn)行。稱取預(yù)處理過的不同時(shí)期的棗果實(shí)各4.0 g，置于預(yù)冷研缽中，加入10 mL 預(yù)冷的50 mmol/L pH 值7.8 的PBS 提取液，冰浴研磨至勻漿。裝入50 mL 離心管中，用20 mL 的PBS 沖洗研缽2 次，沖洗液亦轉(zhuǎn)入離心管中，于4 ℃以10 000 r/min離心20 min，所得上清液即為粗酶液，冰浴保存，用于測定SOD、CAT 活性，測定時(shí)取適量酶液稀釋5 倍。

1.2.1.2 APX 粗酶液的制備 參考張亞宏等[4]的方法進(jìn)行。稱取預(yù)處理過的不同時(shí)期的棗果實(shí)各2.0 g，加入10 mL 預(yù)冷的50 mmol/L pH 值7.0 的PBS 提取液，冰浴研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入50 mL 的離心管中，再加入10 mL 的PBS 沖洗研缽，沖洗液亦轉(zhuǎn)入離心管中，于4 ℃條件下15 000 g 離心15 min，收集所得上清液即為粗酶液，冰浴保存。

1.2.2 酶活性的測定

1.2.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 采用NBT 光化還原法[5]進(jìn)行。試管中分別加入50 mmol/L的PBS 4.05 mL、220 mmol/L 的Met 溶液0.3 mL、1.25 mmol/L 的NBT 溶液0.3 mL、33 μmol/L 的核黃素溶液0.3 mL 和SOD 粗酶液0.05 mL（對(duì)照以緩沖液代替）。將上述試劑混勻后，置于4 000 lx 的光照培養(yǎng)箱中反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后，用黑布罩上試管，終止反應(yīng)。最后在560 nm 波長下測定OD 值，以不照光的對(duì)照管作參比，分別測定其他各管的OD 值。以每克樣品抑制NBT 光化還原50%為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.2.2 過氧化氫酶（CAT）的活性測定 參考張以順等[6]的方法進(jìn)行。取CAT 粗酶液0.2 mL、pH 值7.8 的PBS 1.5 mL、蒸餾水1 mL，在25 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min 后，加入0.1 mol/L 的H2O20.3 mL，每加完一管立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，在240 nm 波長下測定OD 值，每隔1 min 讀數(shù)1 次，共測4 min。以單位時(shí)間內(nèi)（1 min）每克樣品使OD240減少0.1 為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.2.3 抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性測定在張亞宏等[4]方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。在試管中加入磷酸緩沖液1.8 mL、AsA 溶液0.6 mL、APX 粗酶液0.1 mL、蒸餾水0.9 mL。在25 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，再加入H2O20.6 mL，啟動(dòng)反應(yīng)，立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入石英比色皿中，在290 nm 波長下測定OD 值，每隔1 min 讀數(shù)一次，共測4 min，以單位時(shí)間（1 min）內(nèi)每克樣品使OD290變化0.1 定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007 和Microsoft Power-Point 2007 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化

表1 棗果實(shí)生長過程中3 種保護(hù)酶的活性

從表1 和圖1 可以看出，棗果實(shí)幼果期超氧化物歧化酶（SOD）活性較高（411 U/g），到了青果期其活性急劇下降，低至186 U/g，從青果期到全紅期其酶活性又上升了1 倍多，最高達(dá)到398 U/g，全紅期后其酶活性快速下降到最小值129 U/g，在狗頭棗果實(shí)生長過程中SOD 活性整體呈先大幅度下降、后緩慢上升再下降至最低點(diǎn)的變化趨勢。其中，幼果期到青果期SOD 活性大幅度下降；泛紅期到半紅期，SOD 活性由257 U/g 增長到292 U/g，3 個(gè)生長階段活性只增加了35 U/g；全紅期到成熟期又呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵保護(hù)酶之一，SOD 可清除細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧[7]。從試驗(yàn)結(jié)果可知，SOD 在狗頭棗果實(shí)生長過程中酶活性是多變的，沒有規(guī)律。這可能與果實(shí)的生長環(huán)境密切相關(guān)，比如紫外線的影響，紫外線越強(qiáng)，超氧化物歧化酶的活性也就越強(qiáng)。

2.2 過氧化氫酶（CAT）活性的變化趨勢

由表1 和圖2 可知，在狗頭棗果實(shí)生長過程中CAT 活性呈緩慢上升再緩慢下降的趨勢，從幼果期（94 U/（g·min））到青果期（129 U/（g·min））、泛紅期（141 U/（g·min））、半紅期（169 U/（g·min））、全紅期（207 U/（g·min））4 個(gè)生長階段一直呈緩慢上升趨勢；從全紅期開始，到成熟期（195 U/（g·min））、完熟期（146 U/（g·min））活性又下降。進(jìn)一步分析可看出，相比其他相關(guān)酶類，過氧化氫酶（CAT）活性整體變化幅度小，其最大值與最小值之差為113 U/（g·min）。可以在一定程度上說明，過氧化氫酶在狗頭棗生長過程中變化不大，對(duì)其生長生理影響不大。CAT 參與植物生長發(fā)育、逆境脅迫防御應(yīng)答、氧化衰老等生理過程[8]，CAT 對(duì)狗頭棗果實(shí)的保護(hù)在全紅期最強(qiáng)，其他時(shí)期也具有一定的抗脅迫作用[9]。

2.3 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的變化趨勢

由表1 和圖3 可知，棗果實(shí)抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性在幼果期較低（57 U/（g·min）），從幼果期到泛紅期含量幾乎沒有變化，從泛紅期到成熟期活性快速增高到峰值192 U/（g·min），之后又稍有下降，至完熟期降為173 U/（g·min），在狗頭棗果實(shí)生長過程中APX 活性整體呈上升趨勢。如果將泛紅期和完熟期視為偶然因素影響，那么整體來看，抗壞血酸過氧化物酶（APX）在狗頭棗果實(shí)生長過程中呈緩慢上升趨勢，即隨著生長時(shí)期的推進(jìn)酶活性越來越高。因?yàn)锳PX 參與植物生長發(fā)育和多種逆境脅迫的響應(yīng)過程，所以可以認(rèn)為，APX 隨著狗頭棗的生長，保護(hù)作用越來越強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

超氧化物歧化酶（SOD）是一種含有金屬的抗氧化酶。它第一個(gè)在活性氧清除系統(tǒng)中發(fā)揮催化作用[10]，催化超氧陰離子（·O2-）進(jìn)行歧化反應(yīng)生成·O2-和H2O2，其作用是避免O2-自由基對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化作用[11]。本研究中，棗果實(shí)的幼果期SOD 活性最高達(dá)到411 U/g，活性很高，這可能與細(xì)胞新陳代謝旺盛、細(xì)胞增殖分化快、細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧多有關(guān)。青果期SOD 活性數(shù)值低至186 U/g，下降幅度較大，可能是SOD 與超氧陰離子自由基（·O2-）發(fā)生歧化反應(yīng)，導(dǎo)致了·O2-濃度的下降，產(chǎn)生了大量的H2O2，造成SOD 的活性受到了較強(qiáng)抑制；青果期后期，由于APX 和CAT 的活性逐漸上升，清除了部分H2O2，導(dǎo)致抑制作用減弱，SOD 的活性又逐漸升高，到全紅期升至398 U/g；全紅期后，SOD 的活性下降較為顯著。這與赤小豆子葉[12]、蘋果果實(shí)[13]的研究結(jié)果是一致的。棗果實(shí)在成熟期后，由于逐漸成熟軟化，果實(shí)細(xì)胞衰老，細(xì)胞功能開始衰退，代謝產(chǎn)生的O2-積累得越來越多，達(dá)到一定程度后就會(huì)嚴(yán)重傷害細(xì)胞，使細(xì)胞SOD 基因表達(dá)減少，因此，SOD 的活性也就降低。

過氧化氫酶（CAT）是生物體內(nèi)重要的清除H2O2的重要酶類之一，SOD 的產(chǎn)物是CAT 催化的底物[14]。CAT 催化H2O2的分解，生成H2O 和O2，阻斷O2在鐵螯合物作用下與H2O2反應(yīng)，生成對(duì)植物有害的·OH[15]。因此，在活性氧清除系統(tǒng)中，CAT 是第2 類保護(hù)酶之一。在婆棗、龍山貢棗[3]、杜梨[16]等的研究中發(fā)現(xiàn)，棗果實(shí)生長發(fā)育過程中CAT 的活性變化有2 種類型，一種是升—降，另一種是降—升—降。在本研究中，棗果實(shí)的活性變化呈升—降類型，屬于單峰趨勢。在全紅期，過氧化氫酶（CAT）出現(xiàn)活性達(dá)到峰值207 U/（g·min），之后其活性呈現(xiàn)較顯著下降趨勢，與婆棗、龍山貢棗的研究結(jié)果相似，都在棗果實(shí)成熟期前后出現(xiàn)活性峰值。這種變化趨勢適應(yīng)了棗果實(shí)成熟過程的生理變化，CAT活性的增高，活性氧的水平降低，保證了棗果實(shí)的生長發(fā)育正常進(jìn)行，在棗果實(shí)發(fā)育成熟過程中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用。

抗壞血酸過氧化物酶（APX）是葉綠體中專一性地清除H2O2的酶，參與活性氧清除系統(tǒng)的第2 步反應(yīng)，催化AsA 與H2O2發(fā)生氧化反應(yīng)，生成單脫氫抗壞血酸（MDAsA）[17]。高等植物中有胞質(zhì)型和葉綠體型2 種類型的APX[18]。煙草[19]、大麥[20]等植物的葉片中含有的APX 活性較高，而本研究中，棗果實(shí)APX活性水平總體較低，幼果期較低（57 U/（g·min）），成熟期達(dá)到峰值（192 U/（g·min）），這可能與其葉綠體的含量相關(guān)。在植物細(xì)胞內(nèi)，AsA 的氧化分解主要由APX 和抗壞血酸氧化酶（AAO）催化[21]。隨著棗果實(shí)的發(fā)育成熟，AsA 的含量也逐漸升高，儲(chǔ)藏過程中細(xì)胞衰老，APX 的底物AsA 減少，完熟期后APX活性隨之下降，可能與專一性的底物AsA 變化有關(guān)。

綜合來看，棗果實(shí)生長過程中3 種保護(hù)酶活性的變化趨勢與成熟衰老密切相關(guān)。SOD 是成熟衰老過程中的關(guān)鍵酶，其參與清除活性氧的第1 步反應(yīng)。CAT 和APX 參與活性氧清除的第2 步反應(yīng)，CAT 是生物體內(nèi)重要的清除H2O2關(guān)鍵酶之一，APX 是清除葉綠體中H2O2的關(guān)鍵酶。SOD、CAT 和APX 這3 種保護(hù)酶協(xié)同清除氧自由基，促進(jìn)棗果實(shí)的生長成熟。由此可推出，適當(dāng)提高棗成熟期棗果實(shí)的3 種保護(hù)酶活性，可以延長棗果實(shí)的貯藏時(shí)間。