曹亞萍，王勇飛，賈孟君，賀嘉欣，張鑫瑞，李 政，喬永剛，宋 蕓

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）具有特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，是分析功能基因表達(dá)水平的常用方法之一[1]?；虮磉_(dá)分析中，可能會因?yàn)闃悠烽gRNA 存在差異而造成試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，而利用內(nèi)參基因可校準(zhǔn)樣品間誤差[2]，降低研究結(jié)果的不科學(xué)性。植物表達(dá)研究一般以管家基因作為內(nèi)參基因[3]，認(rèn)為它們在生命活動中起重要作用且表達(dá)穩(wěn)定，常常不經(jīng)過驗(yàn)證就直接使用。但有研究表明，植物在不同試驗(yàn)環(huán)境、生長階段以及組織部位的不同會導(dǎo)致內(nèi)參基因存在差異[4]。如核桃不定根發(fā)生階段以ACT2 為內(nèi)參基因[5]，而核桃不同組織間則以18S 基因?yàn)閮?nèi)參[6]。因此，植物在特定的環(huán)境與生長階段需要篩選最適內(nèi)參基因。常用評價(jià)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的軟件有GeNorm、NormFinder 等[7]。

連翹（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）為連翹屬多年生落葉灌木，主產(chǎn)于山西、河北、河南、陜西等地[8]。連翹果實(shí)入藥，外可疏散風(fēng)熱、內(nèi)可清熱解毒，藥用價(jià)值較高[9]；植株抗旱性強(qiáng)，早春花開滿枝且顏色亮麗，是優(yōu)良的水土保持和觀賞植物[10]，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。目前，對連翹的研究主要集中在對其化學(xué)成分分離[11]、遺傳多樣性[12]及道地性[13]分析等方面。近年來，研究者開始關(guān)注異型花柱連翹（長花柱和短花柱）的差異性[14]。但關(guān)于異型花柱花器官發(fā)育的內(nèi)參基因篩選尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)通過篩選長花柱和短花柱連翹花器官生長階段穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，旨在為研究連翹花器官生長的基因表達(dá)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

于連翹開花季節(jié)，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園（37°25′N，112°34′E）選擇健壯無病害的長花柱和短花柱植株（均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)趙曉明教授鑒定），分別于花現(xiàn)蕾期、露冠期、初花期、盛花期、末花期取材（圖1），其中，長花柱植株依次命名為L1、L2、L3、L4、L5；短花柱植株依次命名為S1、S2、S3、S4、S5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 合成 利用華越洋植物RNA 試劑盒提取10 個(gè)樣品的總RNA；采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性；使用Nanodorp 2000c 測定RNA 濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄步驟按照全式金試劑盒方法[15]進(jìn)行，模板RNA 濃度為100 ng/μL，產(chǎn)物cDNA 于-20 ℃存儲，用于后續(xù)引物測試和RT-qPCR 分析。

1.2.2 候選基因篩選及引物設(shè)計(jì) 根據(jù)連翹轉(zhuǎn)錄組測序獲得的核酸序列，選擇11 個(gè)常用內(nèi)參基因[16]作為候選：18S 核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S）、60S 核糖體RNA（60S ribosomal RNA，60S）、肌動蛋白7（Actin7，ACT7）、延伸因子1α 家族（Elongation factor 1-α，EF1α）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、組氨酸家族蛋白（Histone superfamily protein H3，HIS）、類脂質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白（Lipocalin-like，LIPL）、核糖體L27e 蛋白家族（Ribosomal L27e protein familay，RP）、核糖體蛋白L17（Ribosomal protein L17，RPL17）、微管蛋白（Tubulin beta chain，TUB）和泛素蛋白家族（Ubiquitin family，UBQ）；另外，選取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中變化微小的7 個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因，分別命名為：FS-1、FS-2、FS-3、FS-4、FS-5、FS-6、FS-7；EF1αH 為已驗(yàn)證的連翹內(nèi)參基因[17]。根據(jù)RT-qPCR 引物的設(shè)計(jì)原則，利用IDT PrimerQuest Tool 分別設(shè)計(jì)19 個(gè)候選內(nèi)參基因的引物，具體信息列于表1。

表1 候選內(nèi)參基因引物信息

續(xù)表1

1.2.3 候選內(nèi)參基因引物特異性檢驗(yàn)和RT-qPCR分析 利用普通PCR 檢測候選基因引物特異性，以短花柱現(xiàn)蕾期cDNA 為模板。PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序列于表2。

表2 PCR 反應(yīng)體系（10 μL）和反應(yīng)程序

RT-qPCR 采用全式金定量試劑盒方法于美國Bio-Rad 公司CFX-96 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序列于表3。

表3 RT-qPCR 反應(yīng)體系（10 μL）和反應(yīng)程序

1.3 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR 擴(kuò)增結(jié)束后，得到連翹花器官生長階段的Ct 值，計(jì)算相應(yīng)的Q 值（2-ΔCt）；使用GeNorm、NormFinder 軟件分析19 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[18]，并利用Microsoft Excel 2016 計(jì)算已分析出的19 個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名的幾何平均數(shù)[19]；使用Origin 8.0 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 質(zhì)量檢測與內(nèi)參引物特異性分析

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖2-A），異型花柱連翹花器官生長階段10 個(gè)樣品的總RNA 均有28S 和18S 這2 條完整清晰的帶，條帶單一無拖尾，說明試驗(yàn)提取的RNA 完整性良好，無降解或僅有少量降解。每個(gè)內(nèi)參基因的產(chǎn)物均為單一條帶，特異性良好，產(chǎn)物片段在75～132 bp，與預(yù)測結(jié)果一致，說明設(shè)計(jì)的引物可用于進(jìn)一步試驗(yàn)（圖2-B）。

超微量核酸蛋白測量儀檢測結(jié)果顯示（表4），10 個(gè)供試樣品的A260/A280值在2.0 左右，A260/A230值均大于2.0，說明提取的RNA 純度較高，無蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽污染，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

表4 總RNA 質(zhì)量檢測結(jié)果

2.2 連翹花器官生長階段候選內(nèi)參基因RTqPCR 分析

以長花柱和短花柱各5 個(gè)花器官生長階段樣品cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 分析，結(jié)果顯示，19 個(gè)候選內(nèi)參基因溶解曲線均為單一信號峰，在達(dá)到退火溫度之前均未出現(xiàn)雜峰，不存在引物二聚體。Ct 值是反映基因表達(dá)豐度的重要參數(shù)，Ct 值大小與基因表達(dá)量成反比。統(tǒng)計(jì)并分析19 個(gè)候選內(nèi)參基因10 個(gè)樣品中的Ct 值分布情況，結(jié)果顯示（圖3），19 個(gè)候選內(nèi)參基因Ct 值在23～38，說明各候選內(nèi)參基因表達(dá)量波動范圍較大，其中，RP、RPL17、TUB、FS-1、FS-3、FS-6 變化相對較大；從Ct 值推測，60S 變化范圍小，且表達(dá)量較高，適合作為內(nèi)參基因，說明不同條件下內(nèi)參基因Ct 值存在差異，因此，篩選內(nèi)參基因尤為重要。

2.3 候選內(nèi)參基因在連翹花器官生長階段的表達(dá)穩(wěn)定性分析

表5 19 個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

GeNorm 軟件通過計(jì)算基因的M 值（表達(dá)穩(wěn)定值）評價(jià)基因表達(dá)的穩(wěn)定性，基因的M 值越小基因表達(dá)越穩(wěn)定。由表5 可知，19 個(gè)候選內(nèi)參基因M值均小于閾值1.5，其從小到大依次為：ACT7＝HIS＜60S＜EF1α＜FS-4＜18S＜FS-2＜EF1αH＜FS-7＜GAPDH＜FS-1＜RP＜LIPL＜RPL17＜TUB＜FS-5＜UBQ＜FS-6＜FS-3，說明ACT7 和HIS 穩(wěn)定性最好。配對變異值（Pairwise variation）可以確定標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參基因的使用個(gè)數(shù)，若Vn/n+1＜0.15，則沒必要引入第n+1 個(gè)基因。圖4 結(jié)果顯示，V2/3 小于0.15，說明不需要引入第3 個(gè)內(nèi)參基因，可以選用ACT7 和HIS 組合作為連翹花發(fā)育期的內(nèi)參基因。

NormFinder 軟件利用穩(wěn)定值（Stability value）衡量候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性，穩(wěn)定值愈小說明表達(dá)愈穩(wěn)定。由表5 可知，穩(wěn)定值從小到大依次為FS-4＜18S＜FS-2＜EF1α＜60S＜HIS＜ACT7＜EF1αH＜FS-7＜LIPL＜FS-1＜RP＜GAPDH＜RPL17＜FS-5＜TUB＜UBQ＜FS-6＜FS-3，說明FS-4 為連翹花發(fā)育期表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，18S 次之，F(xiàn)S-3 的穩(wěn)定性最差。

GeNorm 和NormFinder 軟件的分析結(jié)果存在差異，為篩選更可靠的內(nèi)參基因，使用Excel 計(jì)算二者排名的幾何平均數(shù)，結(jié)果表明（表5），幾何平均數(shù)從小到大依次為FS-4＜HIS＜ACT7＜18S＜60S＜EF1α＜FS-2 ＜EF1αH ＜FS-7 ＜FS-1 ＜GAPDH ＜LIPL ＜RP ＜RPL17＜TUB＜FS-5＜UBQ＜FS-6＜FS-3，即FS-4 穩(wěn)定性最好，HIS 次之，二者可共同作為連翹花發(fā)育期的內(nèi)參基因。

3 結(jié)論與討論

內(nèi)參基因篩選是差異基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，理想的內(nèi)參基因在不同條件下表達(dá)量基本不變。但有研究表明，內(nèi)參基因在不同條件下表達(dá)并非絕對穩(wěn)定[20]。本試驗(yàn)中，UBQ、GAPDH 基因的穩(wěn)定性較差，但菠蘿蜜[21]花序的內(nèi)參基因篩選UBQ、GAPDH 基因穩(wěn)定性高，因此，選擇合適的內(nèi)參基因至關(guān)重要。GAPDH 和ACT 是植物最常用的內(nèi)參基因[22]，其已在許多物種中被證實(shí)；但內(nèi)參基因也可能是其他基因，如灰氈毛忍冬花蕾期以18S 作為內(nèi)參基因[23]；羽衣甘藍(lán)柱頭發(fā)育期篩選出TUB＋ACT為內(nèi)參基因[24]；OfRAN1＋OfIDH 是桂花在不同光周期和溫度處理下最佳內(nèi)參基因組合[25]；柑橘低溫脅迫下選取UBQ10、ACT 和18S 為內(nèi)參基因[26]。本研究篩選出的內(nèi)參基因?yàn)镕S-4 和HIS，其中，F(xiàn)S-4 為連翹花器官生長階段特有的內(nèi)參基因，與其他物種不同。

篩選內(nèi)參基因常常以GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件分析基因表達(dá)穩(wěn)定性，這3 個(gè)軟件的核心計(jì)算方法不同，結(jié)果存在差異[2]。本研究采用GeNorm 和NormFinder 軟件分析的內(nèi)參基因穩(wěn)定性不同，結(jié)合Excel 綜合評價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，與馬璐琳等[19]對西南鳶尾花內(nèi)參基因評價(jià)方法一致，具有一定的可靠性。內(nèi)參基因篩選需根據(jù)要求選擇不同軟件進(jìn)行分析，如甜瓜生長發(fā)育[27]以GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件共同評測內(nèi)參基因。本研究未利用BestKeeper 軟件進(jìn)行分析，是由于BestKeeper 軟件只能對10 個(gè)以內(nèi)基因進(jìn)行評測，而本試驗(yàn)選取了連翹花器官生長階段19 個(gè)候選內(nèi)參，不適用于此軟件。崔菲菲等[4]在大白菜營養(yǎng)生殖階段對21 個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，分析軟件與本研究一致。

本研究以異型花柱連翹不同生長階段的花器官為材料，選取19 個(gè)候選內(nèi)參基因，并利用RT-qPCR 技術(shù)結(jié)合GeNorm、NormFinder、Excel 軟件，最終將FS-4 和HIS 作為連翹花器官生長階段的內(nèi)參基因，為研究連翹花器官生長階段的基因表達(dá)提供了理論基礎(chǔ)。