陳 嘉，馮志宏，施俊鳳

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031）

山西老陳醋以“蒸、酵、熏、淋、陳”五步工藝傳承至今[1]，是我國國家地理標(biāo)志性產(chǎn)品，具有鮮明的地方特色。傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程主要分為酒化和醋化階段，食醋的風(fēng)味物質(zhì)大部分是在酒化過程中形成帶入產(chǎn)品的[2-3]，這些風(fēng)味物質(zhì)主要通過大曲中的菌系、酶系產(chǎn)生[4]。酒化中酯類和醇類物質(zhì)主要由酵母代謝合成[5]。酒化階段主要的酵母菌有釀酒酵母、畢赤酵母、漢遜酵母、球擬酵母、假絲酵母等[6]。在傳統(tǒng)山西老陳醋釀造過程中，微生物的生長受到各種因素的影響[7]，如菌種組成、發(fā)酵溫度、酒度、酸度等，它們直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味[8]、色澤[9]、品質(zhì)。我國傳統(tǒng)發(fā)酵制品中廣泛存在著優(yōu)良的自然菌株，可作為分離篩選優(yōu)良野生菌株的重要來源[10]。根據(jù)傳統(tǒng)釀造食品生產(chǎn)的需求，針對不同產(chǎn)品發(fā)酵特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)良菌種的選育并建立相適應(yīng)的發(fā)酵技術(shù)規(guī)范，對于促進(jìn)我國傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品現(xiàn)代化，提高產(chǎn)品市場競爭力具有重要的意義。

本試驗(yàn)從傳統(tǒng)山西老陳醋中分離純化酵母菌菌株，通過26S rDNA測序鑒定。采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）法結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對分離得到的酵母菌發(fā)酵液中的主要揮發(fā)性成分進(jìn)行分析[11]，篩選出產(chǎn)醇香或酯香的酵母菌菌株，對其耐酸性、乙醇耐受性和高溫耐受性進(jìn)行研究，旨在為山西老陳醋用酵母菌菌株的研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

醋醅樣品：于2017年12月采集自山西紫林醋業(yè)有限公司山西老陳醋傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)車間。

酵母基因組DNA提取試劑盒、2×Es Taq Master Mix（含染料），購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；孟加拉紅選擇培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培養(yǎng)基，購自海博生物技術(shù)有限公司；安琪活性干酵母，購自安琪酵母（伊犁）有限公司；乙醇、NaCl、乙酸，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；美藍(lán)試劑，購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3020型全自動(dòng)高壓滅菌器，T100TMThermal Cycler PCR儀，Centrifuge 5415R高速冷凍離心機(jī)，ZHWY-103B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱，OLYMPUS CX21型顯微鏡，BS224S型電子天平，自動(dòng)SPME進(jìn)樣器，DB-Wax型毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），TRACE-ISQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，20 mL進(jìn)樣瓶，65 μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯（PDMS/DVB）纖維萃取頭。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離純化

準(zhǔn)確稱取10 g醋醅樣品置于90 mL生理鹽水中，28 ℃振蕩培養(yǎng) 30 min，依次稀釋至 10-5、10-6，取100 μL稀釋液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h。挑取具有典型酵母菌落特征的單菌落，劃線分離純化[12]。將具有酵母細(xì)胞特征的菌株轉(zhuǎn)入YEPD斜面培養(yǎng)基，4℃保存，備用。酵母菌活化后接種到Y(jié)EPD瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)；載玻片上滴加1滴0.05%美藍(lán)試劑與少量菌體混勻，加蓋玻片，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 菌株26S rDNA分子鑒定

根據(jù)酵母基因組DNA提取試劑盒操作說明提取酵母基因組DNA，核酸蛋白測定儀ND-1000測定DNA純度、濃度，-80℃保存[13]。參考GenBank上已登錄的代表菌株26S rDNA近5’端的D1/D2區(qū)域序列（登錄號：KC442921.1），設(shè)計(jì)1對特異性引物，引物序列為（5’-3’）：NL-1(GCATATCAATAAGC GGAGGAAAAG)和NL-4(GGTCCGTGT TTCAAGACGG)。以不同酵母基因組DNA為模板，構(gòu)建15 μL PCR反應(yīng)體系[14]：正反向引物（10 μmol·L-1）各 0.6 μL，基因組 DNA 模板0.8 μL，ddH2O 5.5 μL，2 × Es Taq Master Mix 7.5 μL。反應(yīng)條件：94℃3 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，交由北京華大中生科技發(fā)展有限公司測序，測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對。

1.2.3 發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

接一環(huán)斜面菌種于5 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)1 d，按20%（V/V）接種于山西老陳醋物料中，發(fā)酵釀醋，澄清過濾，4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｎ? mL上清液置于20 mL的分析瓶中，加入0.6 g NaCl加蓋封口。采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣法[15]：①頂空進(jìn)樣器條件：振蕩溫度45℃，振蕩時(shí)間2 min，進(jìn)樣量2 mL。②氣相色譜（GC）分析條件：色譜柱為 TR-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度 300℃，載氣 He，流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 350 μL，分流比為 20∶1；升溫程序：起始溫度40℃，保持3 min，以3℃/min的速度升溫至190℃，保持5 min，以20℃/min的速度升溫至270℃，保持5 min；③質(zhì)譜（MS）條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度280℃，四極桿溫度180℃，質(zhì)量掃描范圍（m/z）：35~500。

1.2.4 酵母菌耐酸性

將活化后的酵母菌懸液按3%的接種量接種于pH 分別為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 的 YEPD 液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)72 h，將培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min，棄上清，稱量菌體濕重。

1.2.5 酵母菌的乙醇耐受性

將活化后的酵母菌懸液按3%的接種量接種于乙醇濃度分別為6%、8%、10%、12%的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)72 h，將培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min，棄上清，稱量菌體濕重。

1.2.6 酵母菌高溫耐受性

按3%的接種量接種活化后的酵母菌于YEPD液體培養(yǎng)基中，分別置于 30、35、40、45、50 ℃條件下培養(yǎng)72 h，將培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min，棄上清，稱量菌體濕重[16]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 24軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌菌株的篩選與鑒定

從傳統(tǒng)山西老陳醋的發(fā)酵過程中進(jìn)行酵母菌菌株的篩選。通過菌種形態(tài)觀察以及利用顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)和菌絲形態(tài)，初步獲得了5株菌株，有待進(jìn)一步鑒定。

提取該5株菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以市售安琪活性干酵母為對照（CK），擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

由圖1可見，共擴(kuò)增出6條特異條帶?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，測序，Blast序列同源性比對，結(jié)果見表1。Blast結(jié)果顯示，菌株Y1為釀酒酵母，Y26為畢赤酵母，Y30為假絲酵母，Y68為紅酵母，Y70為盔形畢赤酵母。

表1 不同菌株26S rDNA鑒定結(jié)果Table 1 Identification of different strains by 26S rDNA

2.2 增香酵母發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵工藝中，微生物發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性成分，風(fēng)味物質(zhì)主要為醇類和酯類。利用HS-SPME-GC-MS法分析6種酵母菌發(fā)酵液中的揮發(fā)性成分，空白組為不添加酵母發(fā)酵液，結(jié)果見表2。由表2可知，不同酵母菌發(fā)酵液中，揮發(fā)性成分種類和數(shù)量之間差異較大。Y1發(fā)酵液中醇類揮發(fā)性物質(zhì)相對峰面積最大，為52.31%，占其總揮發(fā)性物質(zhì)一半以上。6種發(fā)酵液中均有酯類揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生，且Y1、Y26、Y30、Y68 和 Y70 發(fā)酵液中揮發(fā)性酯類峰面積均比對照組中多；Y70發(fā)酵液中酯類物質(zhì)相對峰面積最大，為37.76%，其中乙酯類為30%，占總酯類物質(zhì)79.45%。Y26和Y70發(fā)酵液中均有己酸異戊酯和乳酸乙酯產(chǎn)生；其中乳酸乙酯帶有發(fā)酵香氣，是構(gòu)成山西老陳醋香氣的重要組成成分。

2.3 增香酵母的發(fā)酵特性試驗(yàn)

2.3.1 耐酸性

傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵工藝又稱為“三邊”發(fā)酵，即邊糖化、邊酒化、邊醋化。整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中，酵母菌通常與醋酸菌、乳酸菌同時(shí)作用，因此酵母菌必須適應(yīng)產(chǎn)酸菌造成的酸性環(huán)境并能良好生長。發(fā)酵過程中，有機(jī)酸不斷形成和累積，pH范圍為3.6~3.9。適宜于

山西老陳醋的酵母菌必須有良好的耐酸性，一般要求能耐受pH 3～3.5。由圖2可以看出，Y30和Y26在pH 3～3.5發(fā)酵液中生長良好，具有一定耐酸性。

表2 發(fā)酵液中醇類、酯類成分的GC-MS 分析結(jié)果Table 2 Determination of alcohols and esters in fermentation broth by GC-MS

2.3.2 乙醇耐受性

傳統(tǒng)山西老陳醋固態(tài)發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵液中乙醇濃度的增加，酵母菌受到的乙醇脅迫越來越大。山西老陳醋發(fā)酵過程中乙醇最高濃度達(dá)10%，高濃度乙醇影響酵母菌的生長和發(fā)酵能力，進(jìn)而限制產(chǎn)物濃度的提高，因此所用酵母應(yīng)具有較好的乙醇耐受性，一般要求菌種至少能耐受10%的乙醇。由圖3可以看出，Y26在10%乙醇發(fā)酵液中生長良好，具有較好的乙醇耐受性。

2.3.3 高溫耐受性

傳統(tǒng)山西老陳醋固態(tài)發(fā)酵過程中，酵母菌與醋酸菌共存并同時(shí)代謝，醋酸菌有氧呼吸釋放大量的熱，導(dǎo)致物料溫度最高上升到42～45℃。傳統(tǒng)酵母發(fā)酵最適溫度為28～33℃，溫度變化導(dǎo)致微生物生長和繁殖速度改變以及微生物酶活性的變化，進(jìn)而影響產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量。因此酵母菌須適應(yīng)高溫環(huán)境并良好生長。由圖4可以看出，隨著發(fā)酵液溫度的升高，菌株生長均受到抑制，各菌株間差異不顯著。

3 結(jié)論

從傳統(tǒng)山西老陳醋中分離篩選得到5株酵母菌，經(jīng)鑒定Y1為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），Y26為畢赤酵母（Pichia scaptomyzae），Y30為假絲酵母（Candida humilis），Y68 為紅酵母（Rhodotorula sp.），Y70為盔形畢赤酵母（Pichia membranifaciens）。經(jīng)固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析這5株酵母菌發(fā)酵液的主要揮發(fā)性醇類和酯類物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性成分種類和數(shù)量之間差異較大，其中釀酒酵母Y1發(fā)酵液中醇類揮發(fā)性成分最多，但種類少于畢赤酵母Y26和紅酵母Y68。這5株酵母菌醇類揮發(fā)性物質(zhì)中，均含有乙醇、苯乙醇、2-乙基己醇和糠醇，它們具有強(qiáng)烈的香味。畢赤酵母Y26和盔形畢赤酵母Y70發(fā)酵液中酯類揮發(fā)性成分含量較高，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)相對較大，醋酸乙酯含量較高。

5株酵母菌發(fā)酵特性研究結(jié)果表明，假絲酵母Y30具有優(yōu)良的耐酸性，在pH 3～3.5時(shí)仍生長良好，推測是1株嗜酸酵母菌；畢赤酵母Y26具有優(yōu)良的乙醇耐受性，且具有高產(chǎn)乙酯類、低產(chǎn)高級醇的特性。綜合比較，畢赤酵母Y26有望開發(fā)為山西老陳醋的新型發(fā)酵劑。