葉義全 洪凱 張家君 曹光球 林思祖 楊強(qiáng) 許珊珊

(福建農(nóng)林大學(xué)，福州，350002)

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國特有的重要用材樹種之一，因其具有干形優(yōu)美、材性優(yōu)良和速生豐產(chǎn)等特點，在我國南方林區(qū)廣泛種植[1-2]。第八次全國森林資源清查結(jié)果表明，我國杉木人工林面積約占人工喬木林面積的19.01%，蓄積約占我國人工林蓄積的25.18%，面積和蓄積均居于在我國主要造林樹種的首位[3]。因此，對保障我國木材和生態(tài)安全具有重要意義。杉木主要分布在我國南方富鐵鋁化酸性土壤中，大量研究表明鋁毒是酸性土壤中影響植物生長，導(dǎo)致人工林產(chǎn)量下降和森林退化的主要原因之一[4-10]。近年來，隨著全球酸沉降的加劇和不當(dāng)施肥的影響，我國土壤酸化面積仍在不斷擴(kuò)大，酸化程度也在不斷加深[11-12]。土壤酸化導(dǎo)致其中的活性鋁被大量釋放，顯著增加土壤中鋁的含量[13-14]，從而進(jìn)一步加劇鋁對杉木的毒害。因此，在目前我國土壤酸化不斷加劇的背景下，如何增強(qiáng)杉木的耐鋁能力已成為當(dāng)前我國林業(yè)生產(chǎn)中亟需解決的重大問題。

選育耐鋁的杉木優(yōu)良品系是解決上述問題的重要途徑之一，但這是建立在我們對杉木耐鋁調(diào)控機(jī)制了解的基礎(chǔ)上。為此，眾多學(xué)者分別從抗氧化酶活性、養(yǎng)分吸收、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和根系分泌物等不同角度對杉木鋁毒展開了大量研究[15-24]，并取得一定成效。這些結(jié)果也初步揭示了鋁對杉木毒害的作用機(jī)理以及抗氧化酶和根系分泌物在調(diào)控杉木耐鋁性中的關(guān)鍵作用。植物葉片是光合作用的主要部位和鋁毒害的關(guān)鍵位點之一，然而目前有關(guān)鋁對杉木葉片光合特性的影響，特別是從葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉片光合特性角度共同揭示杉木幼苗對鋁毒脅迫響應(yīng)的研究尚未見報道。鑒于此，本研究以杉木實生幼苗為材料，分析鋁脅迫下杉木光合氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒馓匦院腿~綠體超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，以期從光合生理角度揭示鋁導(dǎo)致杉木生長受抑的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)條件

以福建省尤溪國有林場的三代種子園種子(YX10)為試驗材料。將種子用超純水清洗3遍，接著用0.3%高錳酸鉀溶液消毒30 min后，用超純水清洗干凈。隨后將種子置于超純水靜置2 h，去掉漂浮在液面的空粒和澀粒。上述處理結(jié)束后將種子置于初始溫度為45 ℃溫水中自然冷卻至室溫并浸泡至24 h。隨后將種子置于含有3 mmol/L的CaCl2溶液的濾紙紙板上萌發(fā)；萌發(fā)25 d后，將長勢一致的杉木幼苗置于10 L的培養(yǎng)框中培養(yǎng)。營養(yǎng)液為改良霍格蘭營養(yǎng)液，營養(yǎng)液pH=5.5±0.1。杉木幼苗培養(yǎng)放置于培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)條件：晝夜循環(huán)與溫度分別為：光照14 h、25 ℃，黑暗10 h、22 ℃，光合有效輻射110 μmol·m-2·s-1，相對濕度為75%，培養(yǎng)1周后，選取長勢基本一致的幼苗進(jìn)行處理。本試驗共設(shè)兩個處理，分別為對照(CK)和鋁處理(Al)，所用鋁處理濃度為0.5 mmol·L-1，每處理均設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)21株苗，處理30 d后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)測定。

1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

1.3 光合作用氣體交換參數(shù)的測定

光合作用氣體交換參數(shù)按葉義全等[1]的方法進(jìn)行。選擇在晴天上午(09:00—11:30)進(jìn)行光合作用氣體交換參數(shù)測定。試驗處理結(jié)束時，利用LI-6400便攜式光合儀(Li-Cor，Lincolin，USA)對不同處理下杉木幼苗第1輪枝條上的健康成熟葉的光合氣體交換參數(shù)進(jìn)行測定，主要包括葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)等指標(biāo)。測定時選擇紅藍(lán)光源葉室，葉室溫度設(shè)定為(25±0.5)℃，CO2摩爾分?jǐn)?shù)為400 μmol·mol-1，葉室流速400 μmol·s-1，光合有效輻射1 000 μmol·m-2·s-1。

1.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

試驗處理結(jié)束時，分別取對照和鋁處理中成熟的杉木葉片組織塊各20片。將組織放入2.5%戊二醛-磷酸緩沖液固定6 h后，用0.1 mmol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。接著用2%的鋨酸固定液固定2 h,隨后再用0.1 mmol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。分別在以下幾個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的乙醇洗脫液中進(jìn)行連續(xù)脫水處理：體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇放置15～20 min、體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇放置15～20 min、體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇放置15～20 min、體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇和體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮(1∶1，v/v)放置15～20 min、體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮放置15～20 min，以上操作在冰上進(jìn)行；體積分?jǐn)?shù)為100%丙酮在室溫環(huán)境下放置15～20 min，3次。處理結(jié)束后將樣品寄往上海師范大學(xué)電鏡中心進(jìn)行后續(xù)處理和拍照。

1.5 葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

杉木葉片的葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用乙醇浸提法。試驗處理完成時，選取與測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)統(tǒng)一部位和發(fā)育程度一致葉片，用超純水將葉片清洗干凈，然后用吸水紙吸干并剪去葉片主脈。提取時稱取0.10 g杉木鮮葉，加入5 mL 95%乙醇充分研磨，隨后將研磨液倒入10 mL離心管；接著用3 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇清洗研缽，將清洗液倒入10 mL離心管，隨后將研磨液置于暗處靜置3 h進(jìn)行提取。提取結(jié)束后過濾，并將濾液定容至25 mL容量瓶中，每個處理4個重復(fù)。采用分光光度計分別測定提取液664、647和466 mm處的吸光度。根據(jù)Arnon[25]公式計算不同處理下杉木葉片中葉綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.6 相對根系伸長測定

將長勢和根長基本一致的杉木幼苗分別轉(zhuǎn)移到對照和鋁處理溶液中生長30 d。處理結(jié)束后分別測定處理前后杉木根系長度，每個處理測21株苗。相對根系伸長為鋁處理的根系伸長量相對于對照處理根系伸長量的百分比。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分別采用DPS 7.5軟件進(jìn)行方差分析(ANVOA)，平均值間顯著性差異采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行檢，并用EXCEL進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁對杉木幼苗生長的影響

由表1可知，鋁脅迫下杉木根系伸長受到顯著抑制，與對照相比，鋁脅迫下杉木根長僅為對照的64.04%。此外，鋁脅迫下杉木幼苗根系生物量、地上部生物量以及植株生物量也顯著低于對照處理，分別較對照下降了48.63%、42.39%和44.03%(表1)。

表1 鋁脅迫處理對杉木根系伸長和生物量的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 鋁對杉木葉片光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖表2可以看出，鋁脅迫處理顯著降低杉木葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，鋁處理下葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為對照處理的78.55%。類似地，鋁脅迫同樣降低杉木葉片類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對照下降了21.66%(表2)?？梢?，鋁脅迫處理會抑制葉綠素和類胡蘿卜素的合成或促進(jìn)其降解，導(dǎo)致植株葉片葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，進(jìn)而對植物光合作用產(chǎn)生影響。

表2鋁脅迫處理對杉木葉片葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

處理葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)/mg·g-1類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)/mg·g-1CK(1.96±0.05)a(21.76±0.44)aAl(1.54±0.05)b(17.05±0.64)b

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 鋁脅迫對杉木幼苗葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)的影響

由表3看出，鋁脅迫處理增加了杉木葉片初始熒光(Fo)值，但與對照相比不存在顯著差異；與對照相比，鋁脅迫下Fo增幅為11.60%，這一結(jié)果暗示鋁脅迫下PSⅡ反應(yīng)中心可能受到破壞或可逆失活。鋁脅迫下杉木葉片最大熒光(Fm)和可變熒光(Fv)都表現(xiàn)出下降趨勢，且與各自對照相比均達(dá)到顯著水平，分別比各自對照降低14.05%和15.69%，表明鋁脅迫處理能顯著抑制PSⅡ反應(yīng)中心活性，導(dǎo)致光合電子傳遞過程受阻。鋁脅迫顯著降低杉木葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)值，與各自對照相比，鋁脅迫下杉木葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值分別下降2.63%和22.61%，暗示鋁脅迫使PSⅡ反應(yīng)中心受損，降低杉木葉片對光能的轉(zhuǎn)化與利用效率。此外，與對照相比，鋁脅迫顯著降低杉木PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率值，表明鋁脅迫下杉木葉片光合電子傳遞速率受到顯著抑制。鋁脅迫下，杉木葉片光化學(xué)淬滅值顯著降低，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)顯著增加，分別較各自對照下降25%和增加76.92%。上述結(jié)果表明鋁脅迫顯著抑制了光系統(tǒng)PSⅡ電子傳遞活性與光氧化速率；且由于鋁脅迫抑制了植物對光能的利用效率，導(dǎo)致更多的光能通過非光化學(xué)淬滅形式耗散，而用于光合碳同化的能量顯著降低。綜上所述，鋁脅迫下杉木生長受抑可能與其葉片具有較低的光能利用效率有關(guān)。

表3 鋁脅迫處理對杉木葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 鋁脅迫對杉木幼苗葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

光合作用是植物進(jìn)行碳同化，進(jìn)而促進(jìn)植物生長的基礎(chǔ)。植物葉片是光合的主要部位同時也是鋁毒害的主要位點。因此，鋁脅迫必然會對植物光合作用產(chǎn)生影響，進(jìn)而對植物生長產(chǎn)生調(diào)控作用。與鋁顯著抑制杉木生長結(jié)果一致(表1)，鋁脅迫下杉木葉片凈光和速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)顯著下降，分別是各自對照的40.56%、40.00%和48.81%(表4)，但鋁脅迫處理下杉木葉片胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)(Ci)則顯著上升(表4)。上述結(jié)果表明，鋁脅迫顯著抑制杉木葉片光合作用可能是鋁抑制杉木生長的主要原因之一。

2.5 鋁脅迫對杉木幼苗葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，正常條件下葉綠體緊貼細(xì)胞壁，具有完整的結(jié)構(gòu)，呈梭形，基粒類囊體片層結(jié)構(gòu)清晰，片層數(shù)量較多，排列緊密(圖1A、1B)。鋁脅迫處理下的葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，葉綠體局部膨脹腫起，體積變大，葉綠體內(nèi)部基質(zhì)片結(jié)構(gòu)斷裂解體，基粒減少，分布不均，且基粒類囊體片層排列不規(guī)則，葉綠體細(xì)胞整體上呈現(xiàn)紊亂無序的狀態(tài)(圖1C、1D)。此外，與對照相比，鋁脅迫處理下未見有淀粉粒存在于葉綠體中(圖1)。上述結(jié)果表明，鋁脅迫導(dǎo)致植物光合效率和光能利用率顯著下降，與鋁破壞葉綠體超微結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表4 鋁脅迫處理對杉木葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Chl.葉綠體Chloroplast；Cw.細(xì)胞壁Cell wall；Sg.淀粉粒Starch granule；Gl.基粒片層Grana lamella；Os.嗜鋨體顆粒Osmiophilic；A和C白色標(biāo)尺Bar=2 μm；B和D白色標(biāo)尺Bar=1 μm。

圖1鋁對杉木葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討論與結(jié)論

眾所周知，鋁脅迫引起的根系伸長受抑是植物遭受鋁毒害的典型癥狀[14]。本試驗中鋁脅迫處理不但顯著抑制杉木根系的伸長，同時對杉木的生長同樣具有明顯的影響，鋁脅迫下杉木單株生物量顯著下降，這與前人關(guān)于鋁脅迫能顯著抑制植物生長的結(jié)論相一致[26-27]。植株生物量的積累主要來源于葉片光合碳同化過程，因此葉片光合碳同化能力是影響植物生長的關(guān)鍵因素。一般認(rèn)為，植株光合能力與生長量呈正相關(guān)。例如，劉冉等[28]研究表明，鹽脅迫顯著抑制番茄葉片的光合能力，從而使植株生物量顯著降低。馬新明等[29]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鉛脅迫濃度的升高，烤煙光合速率和產(chǎn)量不斷降低。類似地，李淮源等[30]也發(fā)現(xiàn)，在高濃度鋁脅迫處理下(250和500 μmol·L-1)，烤煙生物量和光合速率均受到顯著抑制。本研究顯示，杉木幼苗在鋁脅迫下，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度及蒸騰速率均顯著下降，而胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)則顯著升高，進(jìn)一步證實鋁脅迫引起的生物量下降和葉片光合能力呈顯著正相關(guān)。研究表明，逆境脅迫下氣孔性限制和非氣孔限制是引起植物光合速率下降的主要因素[31-32]。前人研究指出，如果葉片光合速率下降，但胞間二氧化碳濃度增加，那么非氣孔性因素是導(dǎo)致植物光合作用能力下降的主要因素[33]。可見，非氣孔性因素是鋁脅迫引起的杉木葉片光合速率降低的主要原因，而此時胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)的增加主要由于光合速率的下降，降低葉片對二氧化碳的利用效率，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)的積累。植物在光合作用過程中對光能的吸收主要通過光合色素實現(xiàn)，如葉綠素和類胡蘿卜素等。因此，一般而言植物光合能力的大小與葉綠素和類胡蘿卜素含量密切相關(guān)[34]。葉綠素是PSⅡ光反應(yīng)中心的色素分子，在光能吸收和傳遞中扮演重要角色，而類胡蘿卜素除了參與光能吸收外，還作為葉綠體細(xì)胞的內(nèi)源抗氧化劑，在吸收過剩光能，淬滅活性氧保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)完整性中起著十分關(guān)鍵的作用[35]。本試驗中，我們發(fā)現(xiàn)鋁脅迫處理顯著降低杉木葉片葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，暗示鋁脅迫可能使光合色素合成受阻或促進(jìn)其降解，從而抑制杉木葉片對光能的吸收和利用，最終降低植物的光合速率。可見，葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降也是導(dǎo)致鋁脅迫下杉木葉片光合速率降低的重要原因之一。值得注意的是，葉綠體超微結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，鋁脅迫下杉木葉綠體局部膨脹腫起，體積變大，葉綠體內(nèi)部基質(zhì)片結(jié)構(gòu)斷裂解體，基粒減少，分布不均且排列不規(guī)則，表明鋁脅迫下杉木葉片葉綠體結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞。此外，鋁脅迫還破壞了杉木葉綠體中正常的光合產(chǎn)物積累，進(jìn)而引起淀粉粒的消失，這與鋁脅迫下常綠楊的研究結(jié)果一致[36-37]。葉綠體作為光合作用的主要場所，其結(jié)構(gòu)的破壞可能也是導(dǎo)致鋁脅迫顯著降低杉木葉片光合能力的主要原因之一，該結(jié)果與葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明鋁脅迫下葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降可能主要由于鋁促進(jìn)葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)解體導(dǎo)致的。而鋁脅迫下葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的解體可能由于鋁脅迫顯著降低了葉片類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)而降低了其對葉綠體中活性氧的清除能力，從而增加葉綠體中活性氧的積累，最終導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞乃至解體。

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)主要用于分析光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散和分配情況，能有效地反映出各光合機(jī)構(gòu)的運行情況[38]。初始熒光Fo主要用于表征PSⅡ反應(yīng)中心的基本狀態(tài)，其值的大小與PSⅡ天線色素內(nèi)最初激子密度以及天線色素向PSⅡ反應(yīng)中心激發(fā)能傳遞速率相關(guān)[39]。逆境脅迫下該值的增加通常與PSⅡ反應(yīng)中心受到不可逆破壞或可逆失活有關(guān)。本試驗中鋁脅迫處理增加了杉木葉片F(xiàn)o值，暗示鋁脅迫下PSⅡ反應(yīng)中心可能受到破壞或可逆失活，這與理挪等[23]的研究結(jié)果一致。Fm和Fv主要分別用于表征光系統(tǒng)PSⅡ的電子傳遞情況和PSⅡ反應(yīng)中心活性的高低[40]，鋁脅迫下杉木葉片F(xiàn)m和Fv顯著下降，表明鋁脅迫處理能顯著抑制PSⅡ反應(yīng)中心活性，導(dǎo)致光合電子傳遞過程受阻。Fv/Fm主要用于表征光系統(tǒng)PSⅡ的光化學(xué)效率，而且該值的大小與植物光合速率密切相關(guān)[36]。本研究中杉木葉片在鋁脅迫下其Fv/Fm顯著下降，這與鄭陽霞等[41]在西瓜上的研究結(jié)果一致，表明鋁脅迫降低葉片光化學(xué)效率。此外，鋁脅迫處理還顯著降低了Fv/Fo值，F(xiàn)v/Fo主要用于表征PSⅡ的潛在光化學(xué)活性，該值越高代表具有活性的反應(yīng)中心數(shù)量越多，能更有效地將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[40]。因此，鋁脅迫下該值的下降，進(jìn)一步說明鋁脅迫下杉木葉片對光能的轉(zhuǎn)化效率顯著下降。鋁脅迫下F0的增加及Fm、Fv、Fv/Fm和Fv/Fo的下降共同表明，鋁脅迫處理導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心受損，降低電子傳遞速率，阻礙了NADPH和ATP的合成，無法暗反應(yīng)提供更多的能量，最終導(dǎo)致光合碳同化能力的下降。植物吸收的光能，除了一部分用于光化學(xué)反應(yīng)外，余下的光能主要通過葉綠素?zé)晒夂头枪饣瘜W(xué)途徑耗散[42]。其中葉綠素?zé)晒夂纳⑼緩接挚杉?xì)分為非光化學(xué)淬滅和光化學(xué)淬滅形式[43]。光化學(xué)淬滅與光系統(tǒng)PSⅡ電子傳遞活性密切相關(guān)，而非光化學(xué)淬滅則主要反映了植物將多余的光能以熱能形式耗散的能力，是逆境脅迫下植物防止過剩光能對光合機(jī)構(gòu)造成破壞的一種重要保護(hù)機(jī)制[44]。鋁脅迫下光化學(xué)淬滅值顯著降低，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)顯著增加，上述結(jié)果進(jìn)一步表明鋁脅迫下光系統(tǒng)PSⅡ電子傳遞活性受到顯著抑制，而由于鋁脅迫抑制了植物對光能的利用效率，從而導(dǎo)致更多的光能通過非光化學(xué)淬滅形式耗散，防止過剩光能對光合結(jié)構(gòu)造成損傷。由于鋁脅迫下更多的光能以非光化學(xué)淬滅的熱能形式耗散，因此用于光合碳同化的光能顯著減少，導(dǎo)致葉片對光能的利用效率顯著降低，最終影響杉木的生長。

綜上所述，鋁脅迫引起杉木葉片葉綠體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，進(jìn)而導(dǎo)致葉片葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，是鋁脅迫誘導(dǎo)杉木葉片光合速率和光能利用效率下降的主要原因，而鋁脅迫下杉木葉片光合生理響應(yīng)的這些變化最終導(dǎo)致杉木生長顯著受抑。