錢佳怡 隋小宇 潘虹 袁橙 董巖 簡白羽

(齊齊哈爾醫(yī)學院，齊齊哈爾，161006)

紫杉醇(PTX)是從紅豆杉屬植物的樹皮和針葉中提取的一種次生代謝產物[1]，具有廣譜、高效的抗腫瘤效果，尤其是針對非小細胞肺癌、轉移性乳腺癌和難治愈性乳腺癌[2]。由于其在水中溶解度極低，很大程度上限制了其臨床應用。目前，一些藥物載體制劑常用于解決其水溶性問題，例如脂質體、微球、固體脂質納米粒、乳劑等[3]。

白蛋白微粒是由人或動物的白蛋白制備而成的載藥系統(tǒng)[4]，多數由人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)制備而成。白蛋白微粒載藥系統(tǒng)，無毒、生物相容性高[5]，可提高藥物的水溶性[6]，起到緩釋作用[7]。由于白蛋白載藥系統(tǒng)具有以上優(yōu)點，現在越來越多的將其用于藥物制劑，尤其是抗癌藥物制劑的研究或臨床應用中，如紫杉醇白蛋白納米粒[8]。由于紫杉醇白蛋白載藥系統(tǒng)，不僅能降低藥物的不良反應，并且用藥前無需進行皮質激素及抗組胺藥物的預處理，可直接用藥，提高患者用藥的順應性；近年來已經越來越多的應用于卵巢癌、乳腺癌等疾病的臨床治療，成為癌癥治療的一線用藥[9]。

目前，白蛋白微粒的制備方法主要有乳化法-揮發(fā)法、噴霧干燥法、沉淀法等[10-12]。其中，乳化溶劑揮發(fā)法在制備過程中需要用到氯仿等中高毒性的有機溶劑，并且去除有機溶劑耗時長，有殘留風險；噴霧干燥法在制備過程中存在粒徑不均勻、包封率低等問題[10]；而沉淀法操作相對簡單，不需使用中高毒性有機溶劑，且重復性較好，是一種環(huán)境友好并且高效的方法。目前，對于沉淀法制備白蛋白微粒的研究較少[13]。

包封率是白蛋白微粒制備過程中的一個重要評價指標[14]，指被包封入微粒內的藥物與體系中藥物總量的百分比。目前在沉淀法制備白蛋白微粒載藥系統(tǒng)的過程中，包封率的測定主要采用消化法[15]。但消化法在包封率測定過程中需反復離心，操作比較繁瑣。有機溶劑萃取法是一種利用藥物的溶解性，將難溶性游離藥物從體系中萃取出來的一種方法，可以用于脂溶性藥物載體系統(tǒng)包封率的測定，操作簡單且重現性好，多用于載體藥物包封率的測定，但目前很少見到使用該方法測定白蛋白載藥系統(tǒng)包封率的相關研究。因此，本課題擬以紫杉醇白蛋白微粒作為模型藥物，以有機溶劑萃取法進行包封率的測定。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器

紫杉醇(大連美侖生物技術有限公司，質量分數≥98%；紫杉醇對照品(大連美侖生物技術有限公司，質量分數≥99%；牛血清白蛋白(大連美侖生物制藥有限公司)；色譜級甲醇、分析級二氯甲烷(北京百靈威科技有限公司)；水為自制超純水。

JY96-IIN型超聲波細胞破碎儀(上海滬析實業(yè)有限公司)；T6紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；高效液相色譜儀(包括AS1000進樣器、2000-檢測器、PC2001-二元泵、Laballiance工作站，天津市蘭博實驗儀器設備有限公司)。

1.2 紫杉醇質量濃度測定

吸收波長的選擇：取紫杉醇對照品配制為50 mg·L-1的對照品溶液，在200～800 nm范圍內進行紫外-可見全波長掃描。

色譜條件[10]：色譜柱為C18(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為V(甲醇)∶V(水)=75∶25；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為20 μL。

白蛋白微粒的制備：采用沉淀法制備紫杉醇-白蛋白微粒及空白微粒[13]。取處方量PTX溶于適量乙醇作為油相，將BSA分散于適量純化水中作為水相，在冰水浴下將乙醇迅速注入水相中，超聲5 min(超聲3 s，間歇3 s)，在渦旋下向其中加入BSA質量15%的氯化鋅使PTX混懸液與BSA共沉淀，制得PTX-BSA微粒。同法制得空白微粒。

線性范圍的考察：取適量紫杉醇對照品，用二氯甲烷稀釋定容制備成10、15、20、50、75、100 mg·L-1，按試驗設定的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以峰面積對紫杉醇質量濃度進行線性回歸。

精密度：①日內精密度。精密吸取適量儲備液，二氯甲烷稀釋定容制備成40、50、60 mg·L-1，按試驗設定的色譜條件進樣分析，分別進樣5次，記錄色譜圖，計算峰面積。②日間精密度。精密吸取適量儲備液，二氯甲烷稀釋定容制備成40、50、60 mg·L-1，按試驗設定的色譜條件連續(xù)進樣5 d，記錄色譜圖，計算峰面積。

回收率：精密吸取適量紫杉醇儲備液，稀釋至紫杉醇質量濃度為40、50、60 mg·L-1，各3份，按試驗設定的色譜條件進樣分析，計算回收率。

1.3 包封率測定

萃取法測定包封率：精密吸取320 μL紫杉醇白蛋白微粒，加入2 mL二氯甲烷，渦旋5 min，靜置15 min，取下層有機相液體[13]，過膜后按試驗設定的色譜條件進樣分析，計算體系中游離的紫杉醇質量(m1)、投藥量(m2)。計算包封率(E)，E={(m2-m1)/m2}×100%。

游離藥物回收率：精密吸取適量紫杉醇儲備液，加水稀釋至紫杉醇質量濃度為40、50、60 mg·L-1的溶液。取0.32 mL樣品溶液加2 mL二氯甲烷，置于離心管中，渦旋5 min，靜置15 min。取下層清液過濾，取續(xù)濾液，按試驗設定的色譜條件進樣分析，一式三份，計算回收率。

萃取法加樣回收率：精密吸取1 mL空白載體溶液，再精密吸取適量紫杉醇儲備液，加水稀釋至紫杉醇質量濃度為40、50、60 mg·L-1的溶液。取樣品0.32 mL加入2 mL二氯甲烷溶液，置于離心管中，渦旋5 min，靜置15 min。取下層清液過濾，取續(xù)濾液，按試驗設定的色譜條件進樣分析，一式三份，計算回收率。

2 結果與分析

在200～800 nm范圍內進行紫外-可見全波長掃描，結果顯示紫杉醇在227 nm處有最大吸收。因此，高效液相色譜法檢測紫杉醇質量濃度時，確定檢測波長為227 nm。

線性范圍檢測結果表明：紫杉醇在10～100 mg·L-1呈良好線性關系，回歸方程為A=0.691 3ρ+5.925，R2=0.999 5，式中的A為峰面積、ρ為紫杉醇質量濃度。

日內精密度試驗結果表明：低中高3個紫杉醇質量濃度樣品進樣5次，計算峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.63%、1.24%、1.62%。

日間精密度試驗結果表明：低中高3個濃度樣品進樣5次，計算峰面積的RSD分別為1.54%、1.60%、1.44%。

回收率試驗結果表明：低中高3個紫杉醇質量濃度平均回收率，分別為97.6%、95.8%、101.0%。

低中高3個紫杉醇質量濃度的樣品溶液各3份，經二氯甲烷渦旋萃取并過濾后，其濾液中藥物的平均回收率分別為94.86%、95.38%、98.61%(見表1)。

表1 游離紫杉醇回收率測定結果(n=5)

加樣回收率試驗結果表明：低中高3個紫杉醇質量濃度平均回收率，分別為94.80%、96.92%、101.67%(見表2)。

表2萃取法測定紫杉醇白蛋白包封率的加樣回收率測定結果(n=5)

紫杉醇質量濃度(萃取前測量值)/mg·L-1紫杉醇質量濃度(萃取后測量值)/mg·L-1回收率/%4037.9294.805048.4696.926061.00101.67

取3批自制載藥微粒樣品，按試驗設定方法分別測定包封率，每組測定3次，測定結果表明：采用有機溶劑萃取法測定的白蛋白微粒包封率在92.70%～94.10%之間(見表3)。

表3 紫杉醇白蛋白微粒包封率(n=3)

3 討論與結論

在難溶性藥物活性成分的制劑研究中，載體制劑以其特有的優(yōu)越性得到越來越廣泛的關注。其中白蛋白微粒作為一種安全、穩(wěn)定、降解能力高的藥物載體系統(tǒng)，得到了越來越多的應用，而在其進行制備及優(yōu)化過程中，包封率是一個重要的指標。測定包封率時需要分離游離藥物與載體制劑，常用的方法有離心法、消化法等。其中，離心法在測定白蛋白載體藥物包封率時，需要通過離心將蛋白微粒與游離藥物及蛋白進行分離，重現性較差，結果不穩(wěn)定。消化法操作較為復雜，使用不方便。有機溶劑萃取法一般用于脂溶性載體藥物包封率的測定，其操作簡便、分離速度快，且結果較穩(wěn)定。本試驗將該方法用于白蛋白微粒包封率的測定，具有一定的創(chuàng)新性。

在預試驗中，曾對萃取法中的有機相進行了初步篩選，包括二氯甲烷、正己烷及氯仿，綜合考慮藥物在有機相中的溶解度及有機相毒性，最后選擇二氯甲烷作為有機相進行萃取。在包封率測定過程中，未與載體結合的藥物以游離的狀態(tài)存在于體系中；在萃取過程中，游離藥物被萃取到有機相中，而藥物載體不溶于有機相，從而將藥物載體與游離藥物分開。在渦旋過程中，有輕微乳化現象出現，但結果表明，并未對回收率結果產生影響。在操作過程中，應注意渦旋的時間以及樣品與有機相的比例，時間過短游離藥物萃取不完全，時間過長則容易造成藥物載體破壞，導致藥物泄露；樣品與有機相的比例則不應過大，比例過大易造成萃取次數增加，操作繁瑣。

本試驗建立的紫杉醇白蛋白微粒包封率測定方法，操作簡單、結果準確、穩(wěn)定且重現性好，符合方法學要求，對紫杉醇白蛋白微粒的進一步處方優(yōu)化及質量控制具有一定意義，同時對于其他難溶性藥物活性成分的白蛋白載體制劑研究具有一定的參考價值。