張靈芝

（合肥市口腔醫(yī)院；安徽醫(yī)科大學(xué)合肥口腔臨床學(xué)院，安徽 合肥230001）

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞領(lǐng)域一直是學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，干細(xì)胞較強(qiáng)的自我更新能力和定向分化潛能在組織工程中發(fā)揮著重要的作用[1]。人乳牙牙髓干細(xì)胞是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，是再生醫(yī)學(xué)的理想細(xì)胞來(lái)源，它們具有最小的致癌風(fēng)險(xiǎn)、高增殖能力、高多向性和免疫抑制能力，研究表明人乳牙牙髓干細(xì)胞移植對(duì)小鼠肝纖維化具有抗纖維化作用[2]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，乳牙牙髓干細(xì)胞與乳牙牙根生理性吸收的過(guò)程息息相關(guān)[3]，異常的乳牙牙根吸收會(huì)導(dǎo)致乳牙早失或乳牙滯留，乳牙牙髓干細(xì)胞在維系牙齒正常萌出的過(guò)程中有著重要的作用。

炎性微環(huán)境是牙髓疾病最常發(fā)生的一種病理狀態(tài)，嚴(yán)重影響著牙齒的健康，流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)兒童口腔衛(wèi)生狀況日趨嚴(yán)峻，罹患牙髓炎的患兒日趨增多，因此炎癥這種病理狀態(tài)是否會(huì)對(duì)乳牙牙根吸收造成影響？本實(shí)驗(yàn)對(duì)炎性微環(huán)境下人乳牙牙髓干細(xì)胞促破骨細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，探索了炎癥對(duì)乳牙牙根吸收的影響，從而解釋了臨床上乳牙早失的原因之一。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、實(shí)驗(yàn)儀器

主要試劑、實(shí)驗(yàn)儀器如表1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材

乳牙牙髓組織取材于合肥市口腔醫(yī)院兒童口腔科門診就診的6～8歲兒童即將脫落的乳切牙，取材前征得家屬同意，要求兒童無(wú)全身系統(tǒng)性疾病，牙髓牙周組織健康。

表1 主要試劑、實(shí)驗(yàn)儀器

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

酶消化結(jié)合組織塊法培養(yǎng)乳牙牙髓細(xì)胞，用含雙抗的PBS反復(fù)沖洗牙根冠表面，用無(wú)菌探針取出新鮮的牙髓組織放在預(yù)冷的含有雙抗和PBS比例為1∶100的PBS中，反復(fù)沖洗干凈后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀輕輕分割牙髓組織。1000r/min離心5min。棄上清后，加入含1∶1的3mg/mLI型膠原酶和4mg/mLDispase酶混合液1mL，37.5℃每隔5min振蕩，消化70min，加入少量胎牛血清終止消化。離心后棄上清，加入2mL的α-MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），將其置于CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃恒溫）中孵育，每隔1d換液。待細(xì)胞匯集80%后采用有限稀釋法克隆分離培養(yǎng)，待克隆集落形成后正常消化傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將乳牙牙髓細(xì)胞分為正常組和實(shí)驗(yàn)組，正常組細(xì)胞用含有5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用培養(yǎng)液含終濃度為10ng/mL的TNF-α培養(yǎng)。

1.4 成骨、成脂誘導(dǎo)

將第三代細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞匯合至60%～70%時(shí)，更換成骨、成脂誘導(dǎo)液，每隔3d換液，分別誘導(dǎo)3周后，當(dāng)出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)和脂滴時(shí)停止誘導(dǎo)，茜素紅進(jìn)行成骨染色，油紅進(jìn)行成脂染色。

1.5 Real-timePCR檢測(cè)兩組細(xì)胞TRAP、CTSK基因表達(dá)

將正常組和對(duì)照組的牙髓細(xì)胞用TRIzol裂解，提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計(jì)由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如表2所示。

表2 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 人乳牙牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)與純化

用酶消化+組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，3d左右組織塊周圍有牙髓細(xì)胞貼壁爬出，原代培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞如圖1所示。通過(guò)有限稀釋法挑選細(xì)胞，培養(yǎng)7d左右，可見(jiàn)細(xì)胞呈束狀排列，實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞狀態(tài)良好的第三代細(xì)胞作為研究對(duì)象，第三代牙髓干細(xì)胞如圖2所示。

圖1 原代培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞

圖2 第三代牙髓干細(xì)胞

2.2 乳牙牙髓干細(xì)胞的多向分化能力

牙髓干細(xì)胞經(jīng)過(guò)21d成骨、成脂誘導(dǎo)后，用配置好的茜素紅溶液以及油紅O溶液分別對(duì)其進(jìn)行染色，結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)組出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)，如圖3所示。成脂誘導(dǎo)組出現(xiàn)脂滴，如圖4所示，表明乳牙牙髓干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的能力。

圖3 成骨誘導(dǎo)21d后茜素紅染色

圖4 成脂誘導(dǎo)21d后油紅染色

2.3 炎癥微環(huán)境對(duì)乳牙牙髓干細(xì)胞促破骨細(xì)胞形成的影響

用TNF-α模擬炎癥微環(huán)境，以10ng/mL濃度的TNF-α刺激人乳牙牙髓干細(xì)胞，分別檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組促破骨細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)情況，realtimePCR檢測(cè)結(jié)果顯示TNF-α刺激組破骨細(xì)胞特異性蛋白TRAP、CTSK的表達(dá)明顯上升，分別如圖5、圖6所示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5刺激組TRAP表達(dá)明顯上升

圖6刺激組CTSK表達(dá)明顯上升

3 討論

替牙期兒童牙列處于乳恒牙交替的過(guò)程之中，乳牙根的生理性吸收對(duì)于恒牙的正常萌出至關(guān)重要，不同的外界微環(huán)境會(huì)對(duì)乳牙牙根吸收產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了炎癥微環(huán)境下破骨細(xì)胞特異性蛋白TRAP、CTSK的表達(dá)，結(jié)果顯示，炎癥微環(huán)境能促進(jìn)破骨細(xì)胞形成增加，可能會(huì)導(dǎo)致乳牙根的病理性吸收。

骨重建包括骨吸收和骨形成兩個(gè)階段，兩個(gè)階段通常是平衡的。當(dāng)骨吸收超過(guò)骨形成時(shí)，會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)破壞等病理過(guò)程。組織蛋白酶K是半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶家族的一員，通過(guò)活化破骨細(xì)胞高表達(dá)[4]，研究表明，CTSK通過(guò)降解骨基質(zhì)中的I型膠原調(diào)節(jié)骨吸收；在牙源性角化囊腫、成釉細(xì)胞瘤、牙周炎中，骨吸收機(jī)制可能與CTSK相關(guān)[5]，在病理狀態(tài)下，CTSK活性增強(qiáng)，導(dǎo)致骨質(zhì)的破壞與降解，而抑制CTSK的表達(dá)可以減少樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，緩解了牙周炎病變區(qū)的骨質(zhì)破壞[6-7]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了炎癥微環(huán)境中乳牙牙髓干細(xì)胞中CTSK的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CTSK的表達(dá)明顯上升，提示骨吸收活性增強(qiáng)，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)IL-1α可通過(guò)NF-KB信號(hào)通路激活破骨細(xì)胞中CTSK的過(guò)度表達(dá)，引起牙周炎等骨吸收疾病。本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了破骨細(xì)胞特異性蛋白TRAP、CTSK基因表達(dá)的水平，在一定程度上證明了炎癥微環(huán)境能促進(jìn)破骨細(xì)胞形成增加，但通過(guò)何種分子機(jī)制調(diào)控了這一現(xiàn)象的發(fā)生，還有待后續(xù)的研究。