于英杰，朱 紅，董 優(yōu)，宋 煜

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是紅豆杉中的天然活性成分，主要通過(guò)誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制細(xì)胞分裂和增殖，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，目前廣泛應(yīng)用于卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌的治療中［1-2］。由于紫杉醇的水溶性極低（＜1 μg／mL），傳統(tǒng)紫杉醇注射劑Taxol 主要以無(wú)水乙醇和聚氧乙烯蓖麻油（1∶1）混合溶劑為溶媒，聚氧乙烯蓖麻油具有高致敏性、神經(jīng)毒性、腎毒性、心臟毒性、易溶血等不良反應(yīng)，超敏反應(yīng)發(fā)生率高達(dá)30%～41%［3-4］，嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用。 白蛋白結(jié)合型紫杉醇制劑（Abraxane）解決了紫杉醇難溶性問(wèn)題，一定程度上改善了傳統(tǒng)制劑增溶劑的超敏反應(yīng)，但也存在眾多不良反應(yīng)，如骨髓抑制、神經(jīng)毒性、胃腸道反應(yīng)、肝功能異常、肌肉關(guān)節(jié)痛及脫發(fā)等，制約著化療進(jìn)程和療效［5］。 因此，紫杉醇新型制劑仍需要進(jìn)一步研究開發(fā)。 腫瘤細(xì)胞由于代謝異常，導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)還原型物質(zhì)谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量增加，是正常組織細(xì)胞內(nèi)環(huán)境GSH 濃度的4～10 倍，是細(xì)胞外液及循環(huán)系統(tǒng)的1 000 倍以上［6］，具有還原響應(yīng)能力的載藥納米膠束由于能在腫瘤部位快速釋藥，并具有粒徑小、腫瘤靶向性等優(yōu)點(diǎn)而成為紫杉醇新劑型研究的熱點(diǎn)之一［7-8］。 本課題組以可主動(dòng)靶向CD44 受體的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）為親水端，還原敏感二硫鍵為連接臂，甘草次酸為疏水端，通過(guò)酰胺反應(yīng)合成還原敏感型透明質(zhì)酸-甘草次酸偶聯(lián)物（hyaluronic acid-cystamine-glycyrrhetinic acid，HSG），并已成功負(fù)載PTX 形成紫杉醇還原敏感型透明質(zhì)酸-甘草次酸（PTX-HSG）。 本研究旨在制備PTX-HSG 凍干粉針，并初步考察其穩(wěn)定性和血液相容性，為研制紫杉醇新型制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥 PTX 標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100832-201603）；PTX 原料藥（福建南方制藥股份有限公司，批號(hào)：902-1812401）；PTX-HSG（課題組自制）。

1.2 儀器 LC-20AT 儀器高效液相色譜儀（日本島津公司）；380ZLS 激光粒徑測(cè)定儀（美國(guó)Santa Barbara 公司），ALPHA1-2 LD plus 冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ 公司）；UV-9600 紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）

2 方法與結(jié)果

2.1 PTX 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（75∶25，v／v）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：227 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取PTX 10 mg，甲醇溶解，配制200 μg／mL 的貯備液。 采用甲醇梯度稀釋濃度分別為20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg／mL，HPLC 測(cè)定峰面積，以峰面積（A）對(duì)濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為A＝38 676C－1 387.5（r＝0.999 9，n＝3），結(jié)果表明，在0.5～20.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 凍干粉針制備 取已載藥膠束原液，加入對(duì)應(yīng)種類凍干保護(hù)劑，-20 ℃預(yù)凍24 h 后，冷凍干燥，即得載藥膠束凍干粉針。

2.2.1 凍干保護(hù)劑篩選 控制凍干保護(hù)劑濃度為1%，以凍干品外觀、再分散性及粒徑為考察指標(biāo)，考察不同種類凍干保護(hù)劑（甘露醇、乳糖、葡萄糖）對(duì)載藥膠束凍干粉針的影響，結(jié)果見表1。 結(jié)果表明，PTX-HSG 加入1%葡萄糖作為保護(hù)劑時(shí)，外觀良好，且易再分散，24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好，粒徑基本不變，故選1%葡萄糖作為PTX-HSG 的凍干保護(hù)劑。

表1 不同種類凍干保護(hù)劑下PTX-HSG 凍干品的外觀與再分散性（n＝3）

2.2.2 與常用輸液配伍穩(wěn)定性 取PTX-HSG 凍干品，分別用5%葡萄糖溶液、0.9%生理鹽水溶解，置室溫、自然光下分別于0、12、24 h 取樣，測(cè)定粒徑及分布，按“2.1”項(xiàng)下PTX 含量測(cè)定方法測(cè)定PTX含量變化（0 h 溶液中PTX 含量定為100%）。 結(jié)果顯示，5%葡萄糖輸液復(fù)溶24 h 內(nèi)，PTX 含量下降比較緩慢，且粒徑變化不明顯；0.9%氯化鈉輸液復(fù)溶24 h 內(nèi)，PTX 含量下降較明顯，粒徑增大，見表2。因此，用5%葡萄糖注射液作為復(fù)溶溶劑，配伍穩(wěn)定性最好。

表2 PTX-HSG 的配伍穩(wěn)定性結(jié)果（±s，n＝3）

表2 PTX-HSG 的配伍穩(wěn)定性結(jié)果（±s，n＝3）

復(fù)溶時(shí)間0 h 12 h 24 h粒徑／nm 183.8±1.8 185.5±3.6 187.8±4.6 0.5%葡萄糖 0.9%生理鹽水PTX 含量／%100.0±0.03 99.7±0.01 99.4±0.09粒徑／nm 193.1±4.0 203.9±2.7 225.5±2.2 PTX 含量／%100.0±0.02 96.4±0.01 95.4±0.04

2.2.3 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 取PTX-HSG 納米膠束凍干制劑于4 ℃條件下密封保存，分別在0、1、3、6 月內(nèi)對(duì)PTX 含量、粒徑及分布進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表3，PTXHSG 凍干粉針6 個(gè)月內(nèi)，粒徑和PTX 含量基本不變。

2.3 溶血實(shí)驗(yàn) 取兔血適量于真空采血管中，玻璃棒攪拌除纖維蛋白，加入適量生理鹽水混勻，2 500 r／min 離心10 min，棄去上清，反復(fù)洗滌至上清無(wú)色。 5%葡萄糖注射液配制2%紅細(xì)胞混懸液，待用。取PTX-HSG 凍干粉針適量，5%葡萄糖注射液復(fù)溶，稀釋至PTX 濃度為0.5 mg／mL，按表4 中的配制體積，分別加入2%兔紅細(xì)胞混懸液和5%葡萄糖注射液，最終配制PTX 濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.075、0.10、0.20 mg／mL，其中9 號(hào)管和10 號(hào)管分別為0%溶血（A0%）和100%溶血（A100%）。充分搖勻，37 ℃下恒溫水浴1 h 后，3 000 r／min離心10 min，上清液于540 nm 處下測(cè)定其吸光度Asample，計(jì)算溶血百分?jǐn)?shù)。

表3 凍干PTX-HSG 納米膠束的儲(chǔ)存穩(wěn)定性（x±s，n＝3）

表4 溶血實(shí)驗(yàn)試劑配制mL

以市售制劑Taxol 作為對(duì)照，比較本研究中膠束制劑的安全性，結(jié)果見圖1。 結(jié)果表明，在0.01～0.2 mg／mL 濃度范圍內(nèi)，PTX-HSG 載藥膠束相對(duì)市售制劑Taxol，溶血百分?jǐn)?shù)略低（均＜2%）。 當(dāng)溶血性＞5%被認(rèn)為具溶血作用， 因而此制劑具有良好的血液相容性。

3 討 論

圖1 2 種紫杉醇制劑溶血百分?jǐn)?shù)（n＝3）

凍干粉針劑納米膠束存在于水中，易出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，不利于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，可通過(guò)凍干保護(hù)技術(shù)將其 制備成凍干粉針，起到長(zhǎng)期保存的作用。 有些納米膠束結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，冷凍干燥過(guò)程中可能改變其理化性質(zhì)。 因此，需要加入一定量的凍干保護(hù)劑，以保持其理化性質(zhì)穩(wěn)定。 本研究發(fā)現(xiàn)，凍干保護(hù)劑除了改善PTX-HSG 凍干粉針的外觀性狀外， 還影響其粒徑大小。 未加入凍干保護(hù)劑的膠束凍干粉針呈“棉絮”狀，表面塌陷，而加入凍干保護(hù)劑后，膠束凍干粉針外觀得到明顯改善。 同時(shí)，凍干保護(hù)劑甘露醇和乳糖均在不同程度上增加了載藥膠束的粒徑，而葡萄糖則影響較小，推測(cè)可能是因?yàn)槠咸烟鞘菃翁牵Y(jié)構(gòu)為單一的六元環(huán)，沒(méi)有乳糖的二糖結(jié)構(gòu)和甘露醇長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)對(duì)膠束空間結(jié)構(gòu)造成影響。 因此，選擇1%葡萄糖為PTX-HSG 最佳凍干保護(hù)劑。

溶血實(shí)驗(yàn)納米膠束制劑作為注射劑臨床應(yīng)用時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象的發(fā)生。因此，考察納米膠束的溶血性倍顯重要。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在紫杉醇濃度0.01～0.2 mg／mL 濃度范圍內(nèi)，PTXHSG 載藥膠束溶血百分?jǐn)?shù)均＜2%，具有良好的血液相容性。