魏文增，王 宮*，吳華嵩，李世強

（1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州350003；2.康力生技股份有限公司，臺灣 高雄80743）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）多以慢性病為基礎(chǔ)致肝臟持續(xù)受損，引起肝臟纖維結(jié)締組織以及以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）合成過多或降解減少，在肝內(nèi)過度沉積［1-2］。 HF 是慢性肝病重要的病理特征，對患者的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅［3］，對治療慢性肝病至關(guān)重要。 若缺乏有效治療，將發(fā)展為肝硬化，嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)展為肝癌［4］。有研究表明，HF 經(jīng)積極治療可延緩甚至逆轉(zhuǎn)［5］，但目前國內(nèi)外尚無理想的抗肝纖維化藥物。 因此，尋找有效藥物阻斷、延緩及逆轉(zhuǎn)HF 的發(fā)生和發(fā)展在肝病的治療中有重要意義［6］。 較理想的抗肝纖維化藥物應(yīng)具有良好耐受性，對肝臟有特異的靶效應(yīng)，無毒或低毒［7］，天然藥物及中草藥在這方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。 大量的研究資料和民間用藥基礎(chǔ)表明牛樟芝具有防治HF 的作用［8-10］，因此本課題組開展牛樟芝提取物防治大鼠HF 的實驗研究，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD 大鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量（250±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005；飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物飼養(yǎng)室，使用合格證：SYXK（閩）2014-005。

1.2 實驗藥物 秋水仙堿（云南西雙版納藥業(yè)有限公司，批號：170306）；牛樟芝［康力生技股份有限公司（臺灣）公司］，牛樟芝提取物為實驗室自制［11］。

1.3 實驗試劑 四氯化碳（CCl4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20151109）；水合氯醛（源葉生物科技有限公司，批號：Z03D6Y7011）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批 號：20180117）、谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶（AST，批 號：20180118），南京建成生物工程研究所；大鼠透明質(zhì)酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號：1803201）、大鼠層粘蛋白酶聯(lián)免疫（批號：1804202）、大鼠Ⅲ型前膠原肽C 端免疫（批號：1803202）、大鼠Ⅳ型膠原酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒（批號：1804162），上海西塘生物技術(shù)有限公司；花生油（山東魯花集團(tuán)有限公司，批號：20170325）。

1.4 實驗儀器 POCH-100IV diff 全自動動物血液分析儀［希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司］；64R臺式冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN 公司）；MDL 光學(xué)顯微鏡（德國LECIA 公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、給藥及干預(yù) 將SD 大鼠隨機分為正常對照組、模型組、牛樟芝提取物低劑量組（低劑量組）、牛樟芝提取物中劑量組（中劑量組）、牛樟芝提取物高劑量組（高劑量組）和秋水仙堿組各10 只。除正常對照組外，其余各組均給予CCl4花生油溶液（CCl4∶花生油＝1∶1）按1 mL／kg 灌胃，每周2 次，同時予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)8 周。 從造模第1 天開始，低、中、高劑量組分別按75、150、300 mg／（kg·d）予牛樟芝提取物灌胃，秋水仙堿組按1 mg／（kg·d）予秋水仙堿溶液灌胃，正常對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。 每周稱量體質(zhì)量2 次，調(diào)整灌胃量。8 周后麻醉大鼠，收集血清及肝臟，備用。

2.2 肝形態(tài)觀察及肝指數(shù)測定 解剖獲取肝臟后，稱取肝臟質(zhì)量，計算肝系數(shù)。

2.3 肝組織病理學(xué)觀察 取同一部位肝組織浸泡于4%多聚甲醛中固定，按常規(guī)包埋切片，分別予HE 染色和Masson 染色，于光鏡下觀察。

2.4 肝功能指標(biāo)檢測 應(yīng)用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平。

2.5 肝纖維化四項指標(biāo)測定 采用ELISA 法檢測大鼠血清血清透明質(zhì)酸（serum hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（Laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（Ⅲ-type procollagen，PC-Ⅲ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-type collagen，ColⅣ）含量。

2.6 western blot 法測定TGF-β1 蛋白水平 向肝臟組織加裂解液勻漿提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，組織蛋白行SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，常溫下封閉2 h，分別加入TGF-β1 一抗（1∶1 000）及β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，再進(jìn)一步進(jìn)行二抗反應(yīng)，完畢后條帶經(jīng)Bio-RAD 凝膠分析儀進(jìn)行圖像掃描分析，檢測TGF-β1 及β-actin 的灰度值，以蛋白相對表達(dá)量表示。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，組間比較方差齊時，采用LSD 檢驗；方差不齊時，采用Games-Howell 檢驗。 不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis test）。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠一般情況 在整個實驗過程中，試驗大鼠未出現(xiàn)死亡情況。 連續(xù)給藥8 周后，正常對照組大鼠飲食和活動正常，反應(yīng)敏捷，毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)良好；模型組大鼠飲食和活動明顯減少，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)蓬松無光澤，精神萎靡；低劑量組大鼠狀態(tài)與模型組差別不大；高、中劑量組及秋水仙堿組大鼠飲食量、活動度、反應(yīng)靈敏度及精神狀態(tài)較模型組均有不同程度的改善。

3.2 6 組大鼠不同時間點體質(zhì)量比較 見表1。

表1 6 組大鼠不同時間點體質(zhì)量比較（x±s）g

3.3 6 組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)比較 如圖1 所示，正常對照組肝臟顏色紅潤，表面光滑，質(zhì)地柔軟；CCl4所致的模型組肝臟色澤呈黃褐色，表面粗糙呈顆粒狀；牛樟芝提取物組和秋水仙堿組的肝臟較模型組而言，肝臟腫大程度均有不同程度的降低，表面光滑和顏色有一定的好轉(zhuǎn)，更接近正常對照組大鼠肝臟的形態(tài)。

圖1 6 組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)比較

3.4 6 組大鼠肝系數(shù)比較 見圖2。

3.5 6 組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 HE 染色結(jié)果顯示，正常對照組的大鼠肝臟形態(tài)正常；模型組的肝臟脂肪細(xì)胞變性，且被炎癥因子浸潤，大量的纖維結(jié)締組織增生，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，甚至出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)重新構(gòu)建。 牛樟芝提取物組和秋水仙堿組的肝組織脂肪細(xì)胞變性明顯減少，炎癥因子也顯著降低，纖維增生程度明顯減輕，但仍無法恢復(fù)至正常對照組的正常水平。Masson 染色結(jié)果顯示，膠原纖維成深藍(lán)色，與正常組比較，模型組膠原纖維明顯增多，肝小葉結(jié)構(gòu)受到破壞，在給予藥物治療后，HF 呈現(xiàn)一定程度的好轉(zhuǎn)。 見圖3、4。

圖2 6 組大鼠肝系數(shù)比較

圖3 6 組大鼠肝組織HE 染色圖（×100）

3.6 6 組大鼠血清肝功能、肝纖維化指標(biāo)比較 見表2。

圖4 6 組大鼠肝組織Masson 染色圖（×100）

3.7 6 組大鼠肝組織TGF-β1 蛋白表達(dá)比較 見圖5。

4 討 論

牛樟芝（Antrodia camphorata）為臺灣珍貴的藥用真菌，具有解毒保肝、抗氧化、抗炎、強化免疫、抗癌等作用［11-12］。 研究表明，牛樟芝對乙醇誘導(dǎo)的大鼠和四氯化碳引起的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用［13-14］。 劉燕隔［15］通過對急性酒精肝小鼠給予牛樟芝治療后，發(fā)現(xiàn)不僅能有效緩解與抑制由酒精引起的TNF-α 水平的升高，還能緩解酒精攝入引起的IL-10 的炎癥因子降低，從而保護(hù)肝臟。王宮等［9］通過牛樟芝滴丸對大鼠非酒精性脂肪肝研究表明其對肝臟具有保護(hù)作用。

臟器重量和臟器系數(shù)可作為大體確定對應(yīng)器官病變程度的參考［16］。 本研究通過肝臟重量、系數(shù)以及肝組織形態(tài)學(xué)、病理學(xué)比較，牛樟芝提取物各劑量和秋水仙堿組對肝組織均有一定的改善作用，說明牛樟芝提取物對CCl4誘導(dǎo)的大鼠HF 有保護(hù)作用。

表2 6 組大鼠血清肝功能、肝纖維化指標(biāo)比較（x±s）

注：A 正常對照組；B 模型組；C 秋水仙堿組；D 低劑量組；E 中劑量組；F 高劑量組。

圖5 6 組大鼠肝組織TGF-β1 蛋白表達(dá)變化

本研究選用經(jīng)典的CCl4誘導(dǎo)HF 模型，CCl4經(jīng)肝代謝和活化生成強生物毒性自由基（-CCl3）、二氯甲基自由基（·CCl2）和過氧化甲基自由基（·OOCCl2），破壞膜結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致肝組織內(nèi)ALT、AST、LDH 等被釋放進(jìn)入血液循環(huán)中［17-18］。 本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CCl4處理后的大鼠血清ALT、AST、LDH、TB 水平較正常組顯著升高；給予牛樟芝各劑量提取物和秋水仙堿干預(yù)后，大鼠血清ALT、AST、LDH、TB 水平較模型組有一定程度的降低，說明牛樟芝提取物對膜有一定的穩(wěn)定作用，能降低肝損傷程度，對CCl4所致?lián)p傷的肝細(xì)胞有保護(hù)作用。

HF 是各種不同致病因子引起的慢性肝病，包括藥物治療、自身免疫反應(yīng)、輻射和感染等共同的病理基礎(chǔ)和過程，是損傷修復(fù)過程調(diào)節(jié)異常的結(jié)果，主要發(fā)生機制是肝ECM 過度沉積。 ECM 成分為HA、LN、PC-Ⅲ、ColⅣ，即肝纖維四項，是反映HF 的血清標(biāo)志物，用來衡量纖維化程度和炎癥活動度。CCl4通過促進(jìn)肝纖維四項的合成與降解失衡誘發(fā)HF，因此肝纖維四項ECM 含量與HF 程度呈正相關(guān)，可用于評價HF 病變程度［19-21］。 HA 是HF 程度和藥物療效中最敏感、最特異的血清指標(biāo)［22］；LN是非膠原糖蛋白，與炎性反應(yīng)和HF 有關(guān)；PC-Ⅲ是肝結(jié)締組織成分之一，能反映正常肝組織向結(jié)締組織的轉(zhuǎn)換情況；ColⅣ是反映膠原蛋白的生成，在HF 時，可能是最早增生纖維［20］。 TGF-β1 是由激活肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌成纖維細(xì)胞所釋放，是最強的促纖維化細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)ECM分泌，沉積肝組織中，形成HF［23-24］。 本研究結(jié)果顯示，牛樟芝提取物各劑量組和秋水仙堿組與模型組比較，肝纖維四項指標(biāo)和TGF-β1 檢測結(jié)果均有顯著降低，說明牛樟芝提取物能抗肝纖維化。

綜上所述，牛樟芝提取物可改善CCl4致HF 大鼠的精神狀態(tài)、飲食量、體質(zhì)量、活動度及反應(yīng)靈敏度等一般狀況和肝功能生化指標(biāo)，減輕大鼠肝病理損傷、減少肝臟的膠原沉淀，均說明牛樟芝提取物對HF 大鼠具有保護(hù)作用，但其確切機制還需進(jìn)一步研究。