魏麗慧，張晶晶，王 舒，方 翌，陳友琴，彭 軍，林久茂*

（1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2. 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；3. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一。 在我國，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中排第3 位和第5 位［1］。手術(shù)、化療和放療仍是臨床上治療大腸癌常用的策略，這些方法雖然能減少腫瘤的體積，但不能有效解決復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的問題，特別轉(zhuǎn)移性患者治療后5年的生存率低于50%［2］。 研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌干細(xì)胞是大腸癌細(xì)胞中占據(jù)一小部分比例的細(xì)胞群，具有自我更新、無限增殖的能力，在大腸癌的發(fā)生發(fā)展以及治療后腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用［3-5］。 半枝蓮（Scutellaria barbataD. Don）作為天然藥用植物，具有清熱解毒、利尿、散瘀等功效，臨床多用于治療肺癌、大腸癌等腫瘤性疾?。?-11］。課題組前期研究表明，半枝蓮可通過調(diào)節(jié)miRNA 及Wnt、HH 等信號傳導(dǎo)通路抑制大腸癌細(xì)胞增殖、 腫瘤血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12-17］，并且具有抑制大腸癌細(xì)胞中干細(xì)胞比例的作用［18］，但具體的抑制作用機(jī)制尚未闡明。 因此，本文以大腸癌干細(xì)胞為切入點(diǎn)，探討半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞的作用及其調(diào)控機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物和細(xì)胞株 半枝蓮購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂；人大腸癌SW480 細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基、DMEM／F12 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、 胎牛血清、B-27 Sup plement、Antibiotic-Antimycotic、StemPro Accutase cell Dissociation Reagent（美國Thermo Fisher Scientific公司）；AnnexinV-APC／PI 凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；human EGF、human FGFbasic（美國Peprotech公司）；臺盼藍(lán)（美國Amresco公司）；mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（美國TaKaRa公司）；Bcl-2、Bax、GAPDH、二抗（美國Cell Signaling Technology 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、低速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國CountStar 公司）；MOFLO XDP 分選型流式細(xì)胞儀（美國Beckman coulter 公司）；Realtime-PCR 儀（美國ABI 公司）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 常用試劑配制

2.1.1 半枝蓮溶液配制 參考文獻(xiàn)［18］制備半枝蓮乙醇提取物，用DMSO（50%）＋PBS（50%）配制成母液濃度為500 mg／mL 的溶液，超聲溶解后，儲存于-20 ℃冰箱備用。

2.1.2 大腸癌干細(xì)胞培養(yǎng)液配制 在無添加胎牛血清的DMEM／F12 培養(yǎng)基中加入20 ng／mL EGF、20 ng／mL bFGF、1×B27 Supplement 和1% Antibiotic-Antimycotic。

2.2 大腸癌干細(xì)胞培養(yǎng) 運(yùn)用SP 細(xì)胞分選法分離大腸癌干細(xì)胞［19］；分選得到的細(xì)胞用PBS 清洗1 次，加入大腸癌干細(xì)胞培養(yǎng)液，接種在低粘附6 孔板培養(yǎng)板，放培養(yǎng)箱中常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。 每兩天添加培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度達(dá)80%左右時，加入StemPro Accutase cell Dissociation Reagent（干細(xì)胞消化酶）進(jìn)行消化，觀察細(xì)胞變圓且部分漂浮時加入2 倍體積含10% FBS 的L-15 培養(yǎng)液終止消化，1 000 r／min 離心3 min，棄上清，收集沉淀細(xì)胞，用干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸制成單細(xì)胞懸液后傳代或接板。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將培養(yǎng)后的大腸癌干細(xì)胞按1×105個／mL 細(xì)胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔體積為2 mL，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別用不同濃度半枝蓮（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預(yù)24 h 后，用PBS 清洗1 次，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞密度。

2.4 細(xì)胞存活率檢測 上述“2.3”中干預(yù)的細(xì)胞，拍照后，加入干細(xì)胞消化酶進(jìn)行消化收集細(xì)胞，用干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，取10 μL 細(xì)胞懸液與10 μL 0.4%的臺盼藍(lán)混勻，加入計(jì)數(shù)板中，在CountStar 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5 DAPI 檢測細(xì)胞凋亡 用不同濃度半枝蓮干預(yù)大腸癌干細(xì)胞24 h 后，用PBS 清洗1 次，制成細(xì)胞涂片，加入4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，15 min 后用PBS 清洗3 次，加入DAPI 溶液孵育15 min，再用PBS 清洗3 次，封片后用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 用不同濃度半枝蓮干預(yù)大腸癌干細(xì)胞24 h 后，用干細(xì)胞消化酶進(jìn)行消化，收集的細(xì)胞用PBS 清洗1 次，加入200 μL 的Assay Buffer 進(jìn)行重懸，并加入5 μL Annexin V-APC及5 μL PI，室溫避光孵育15 min，再添加200 μL的Assay Buffer，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.7 Bcl-2、Bax mRNA 檢測 用不同濃度半枝蓮干預(yù)大腸癌干細(xì)胞24 h 后，加入1 mL 的Trizol，按常規(guī)方法提取總RNA，測定濃度后取1 μg 樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟； 得到的cDNA按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒的步驟添加PCR 反應(yīng)液，放入PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT相對定量計(jì)算獲得每組基因表達(dá)的水平。

2.8 Bcl-2、Bax 蛋白檢測 以不同濃度的半枝蓮干預(yù)大腸癌干細(xì)胞24 h 后，離心后去除上清，用PBS（預(yù)冷）清洗2～3 遍，加入裂解液RIPA，在冰上裂解15～20 min，用BCA 試劑盒進(jìn)行濃度的測定。采用10% SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳（90 V，40 min；120 V，50 min），電泳結(jié)束進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后封閉液封閉1～2 h，PBS-T 緩沖液中充分振蕩清洗；根據(jù)目的蛋白的分子量加入相應(yīng)的一抗（Bcl-2、Bax、β-actin）進(jìn)行孵育，4 ℃過夜。 孵育結(jié)束后，采用TBS-T 進(jìn)行清洗。 加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。 最后用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色，于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白的表達(dá)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。 結(jié)果用（x±s）表示；先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足條件者，兩組比較采用t 檢驗(yàn)；未滿足條件者，兩組比較用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞生長的影響 不同濃度的半枝蓮處理大腸癌干細(xì)胞后，在倒置顯微鏡下觀察大腸癌干細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果如圖1 所示，對照組細(xì)胞生長較密集， 呈現(xiàn)良好的成球生長，半枝蓮干預(yù)后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，球體變小。

圖1 半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞生長的影響（×100）

3.2 半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的半枝蓮處理大腸癌干細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，實(shí)驗(yàn)組與對照組（100%）比較，細(xì)胞存活率分別為75.92%、60.02%、41.1%。

3.3 半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞凋亡的影響 利用DAPI 染色檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖3 所示，對照組細(xì)胞核熒光呈現(xiàn)弱染狀態(tài)，隨著半枝蓮濃度的增加，出現(xiàn)核高染的細(xì)胞數(shù)增加，表明半枝蓮干預(yù)可促進(jìn)大腸癌干細(xì)胞凋亡的作用。 此外，我們進(jìn)一步采用Annexin V-APC／PI 試劑盒檢測半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果見圖4，隨著半枝蓮濃度的增加，凋亡的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。

3.4 半枝蓮干預(yù)對大腸癌干細(xì)胞Bcl-2 和Bax mRNA表達(dá)的影響 經(jīng)不同濃度半枝蓮處理大腸癌干細(xì)胞24 h 后，如圖5 所示，與對照組比較，Bcl-2／Bax mRNA 的比值隨著半枝蓮濃度的增加，顯著下調(diào)。

3.5 半枝蓮干預(yù)對大腸癌干細(xì)胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，與對照組比較，半枝蓮干預(yù)后，Bcl-2 在蛋白水平的表達(dá)顯著下調(diào)，但Bax 在蛋白水平表達(dá)沒有明顯的改變。 經(jīng)過蛋白灰度值統(tǒng)計(jì)分析，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的Bcl-2／Bax 比值隨著半枝蓮濃度的增加，顯著的下調(diào)；提示，調(diào)控Bcl-2 及Bax 兩者之間的平衡可能是半枝蓮誘導(dǎo)大腸癌干細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

圖2 4 組大腸癌干細(xì)胞活力比較

4 討 論

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中存在的一小部分細(xì)胞，通常處于靜息狀態(tài)，當(dāng)受到外界條件變化如細(xì)胞因子刺激時會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這均源于腫瘤干細(xì)胞擁有很強(qiáng)的自我更新、增殖分化和凋亡抵抗的潛能。 大腸癌發(fā)生、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要原因也是由于大腸癌干細(xì)胞的無限增殖分化和強(qiáng)大的抗凋亡特性所導(dǎo)致［3］，故針對大腸癌干細(xì)胞治療大腸癌已成為研究的熱點(diǎn)。 臨床常用放療、化療的方式治療大腸癌，但給機(jī)體帶來嚴(yán)重的副作用。中藥治療腫瘤具有安全、副作用小等優(yōu)勢，隨著中藥的更深層次研究，其作用機(jī)制也越清晰。 因此，進(jìn)一步加強(qiáng)中藥干預(yù)腫瘤干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，研制出針對腫瘤干細(xì)胞的抗腫瘤藥物，是今后科研工作的主要方向之一。

圖3 DAPI 染色檢測半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞凋亡的影響（×100）

圖4 4 組大腸癌干細(xì)胞凋亡比例比較

圖5 4 組大腸癌干細(xì)胞Bcl-2／Bax mRNA 表達(dá)比較

圖6 4 組大腸癌干細(xì)胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)比較

半枝蓮是天然藥用植物，現(xiàn)代多用于臨床輔助治療各種腫瘤性疾病［6-11］，并且具有顯著的療效?；A(chǔ)研究也表明半枝蓮具有抑制大腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用［12-14］，本課題組前期研究表明半枝蓮具有抑制大腸癌干細(xì)胞比例的作用［18］，但具體的抑制作用機(jī)制尚未闡明清楚。 因此，本文以大腸癌干細(xì)胞為切入點(diǎn)，探討半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及密度，采用4%臺盼藍(lán)檢測觀察半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞生長的影響，結(jié)果均顯示半枝蓮可抑制大腸癌干細(xì)胞生長。 同時，利用DAPI 染色及Annexin V-APC 試劑盒檢測半枝蓮對大腸癌干細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)半枝蓮干預(yù)大腸癌干細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率呈不同程度的增加，由此可知半枝蓮能夠誘導(dǎo)大腸癌干細(xì)胞的凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞凋亡與線粒體外膜通透性（MOMP）有關(guān)，MOMP 增大不僅促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的凋亡， 還能通過阻斷腫瘤干細(xì)胞信號通路如Wnt、Notch 等通路發(fā)揮抑制腫瘤干細(xì)胞增殖的作用［19－20］。研究報(bào)道，Bcl-2 蛋白家族在線粒體介導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［21］。 Bcl-2 家族之間相互作用的異常調(diào)節(jié)會引起MOMP 的變化，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡［20］。 Bcl-2 家族由抗凋亡蛋白（Bcl-2等）、促凋亡蛋白（Bax、Bak 等）以及BH-3 結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白（Bad 等）組成［21-22］。 其中，Bcl-2 和Bax是最具代表性的抑制和促進(jìn)凋亡的蛋白，Bcl-2 與Bax 可形成同源（Bax／Bax）或異源（Bcl-2／Bax）的二聚體，共同作用發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用［23］。 當(dāng)Bcl-2 高表達(dá)和Bax 的低表達(dá)， 導(dǎo)致二者的比值上調(diào)是細(xì)胞發(fā)生凋亡抵抗的重要因素。 因此，二者的比值決定了細(xì)胞的最終命運(yùn)［24］。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸癌干細(xì)胞用半枝蓮處理24 h 后，Bcl-2／Bax 比率顯著降低，提示半枝蓮干預(yù)大腸癌干細(xì)胞24 h 后可改變Bcl-2、Bax 的mRNA 及蛋白的表達(dá)，通過影響兩者之間的平衡，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。