李顯箏，許玲，胡晶晶，黎鳳珍，蔡嬋慧

染色體G顯帶核型分析技術是目前檢測染色體異常的常規(guī)手段。在臨床工作中，染色體的嵌合現(xiàn)象時有發(fā)生，染色體嵌合體中異常核型所占比例不同，對于胎兒的預后影響也不同，從而增加了產(chǎn)前診斷遺傳咨詢的難度。常規(guī)G顯帶技術細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后會改變異常嵌合體的嵌合比例，不能真實反映胎兒的核型情況。通過染色體微陣列比較基因組雜交檢測（chromosomal microarray analaysis，CMA）和熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）能檢測間期未經(jīng)培養(yǎng)細胞的嵌合狀態(tài)，從而減少細胞培養(yǎng)過程對嵌合比例的影響，同時也能減少細胞周期對產(chǎn)前診斷的限制[1]。本文對染色體核型結果提示可能存在染色體嵌合現(xiàn)象的病例進一步用CMA和FISH技術分析確定其異常核型及嵌合比例。

1 對象與方法

1.1 對象 廣東省婦幼保健院（我院）2016年1月—2018年12月因各種產(chǎn)前診斷指征就診的妊娠孕婦，22例行絨毛/羊水細胞體外培養(yǎng)染色體核型G顯帶分析，發(fā)現(xiàn)可能存在染色體嵌合現(xiàn)象，并進一步行CMA和FISH檢測。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析按我實驗室操作規(guī)程進行，常規(guī)核型計數(shù)分析，若出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象時加大計數(shù)量并對備份培養(yǎng)瓶中的細胞進行傳代、收獲和制片，加數(shù)盡量多的核型進行分析。

1.2.2 CMA我實驗室使用安捷倫（Agilent）公司（美國）生產(chǎn)的8×60 K芯片進行全基因組拷貝數(shù)檢測。以正常男性DNA作為對照標準，利用ChAS軟件進行分析。

1.2.3 FISH按我實驗室操作規(guī)程進行，熒光顯微鏡下閱片分析計數(shù)。探針分三組：第一組探針：CEP18（天藍色）探針定位于D18Z1（18p11.1-q11.1），CEPX（綠色）探針定位于DXZ1（Xp11.1-q11.1），CEPY（紅色）探針定位于DYZ3（Yp11.1-q11.1）；第二組探針：LSI13（紅色）探針定位于RB1基因（13q14），LSI21（綠色）探針定位于D21S259，D21S341，D21S342（21q22.13-q22.2）；第三組探針：CEP16（紅色）探針定位于D16Z3（16q11.2），CEP20（綠色）定位于D20Z1（20p11.1-q11.1）。

1.2.4 羊水染色體嵌合評定標準當2個或2個以上的培養(yǎng)物中都至少發(fā)現(xiàn)一個或一個以上的異常細胞克隆，且異常細胞核型相同，判定為“真嵌合體”。若是以下三種情形之一，為“假嵌合體”：①在2個或2個以上培養(yǎng)物中只查到單個異常細胞或細胞克?。虎?個或2個以上的異常細胞克隆都是在同一個培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的；③2個或2個以上培養(yǎng)物中都發(fā)現(xiàn)異常細胞，但異常細胞的核型異常類型不同。

2 結果

2.1 FISH技術在染色體數(shù)目異常嵌合體中的應用 本研究核型結果共發(fā)現(xiàn)22例染色體嵌合體，其中性染色體數(shù)目異常嵌合13例（59%），常染色體三體嵌合6例（27%）。性染色體數(shù)目異常嵌合病例中，僅有3例CMA結果同時提示性染色體嵌合體的存在，其余均未檢測到性染色基因拷貝數(shù)變化，其中#6病例核型結果mos 45，X[84]/46，XY[16]，異常核型45，X比例84%，CMA結果仍提示正常，F(xiàn)ISH結果提示存在XYY/X/XY（43/21/36）三種情況；#1、#2病例涉及多倍體嵌合體，F(xiàn)ISH及CMA結果均為正常，提示為假性嵌合體，不具臨床意義；其余CMA未檢測到基因拷貝數(shù)變化的病例，雖然FISH復查提示仍為嵌合體，但嵌合比例均在10%左右，屬低比例嵌合體，而低比例嵌合對胎兒預后表型影響較小，患者綜合考慮選擇繼續(xù)妊娠。常染色體三體嵌合病例中，共涉及13、16、18、20、21號染色體的嵌合。#14病例核型結果提示多了一條未知來源的標記染色體即mar染色體，經(jīng)CMA和FISH檢測提示mar染色體來源于18號染色體短臂，且嵌合比例約為20%左右；#15、#16、#17、#18病例的核型結果均提示為低比例常染色體三體嵌合（嵌合比例6%、6%、4%、5%），CMA結果提示嵌合比例分別為10%、30%、34%、正常，未經(jīng)培養(yǎng)羊水細胞FISH檢測提示三體嵌合比例分別為11%、25%、38%、10%，均選擇終止妊娠；#19病例核型結果為20號三體嵌合（34%），但CMA結果提示正常，F(xiàn)ISH檢測提示仍為低比例嵌合（3%），病人自愿繼續(xù)妊娠。見表1。

2.2 FISH技術在性染色體結構異常嵌合體中的應用 本研究共發(fā)現(xiàn)3例特殊性染色體結構異常嵌合病例，涉及X雙著絲粒染色體1例，Y雙著絲粒染色體2例。以#22病例為例，該病人CMA結果提示檢測出致病性CNV：①胎兒在Yp11.31q11.222位置發(fā)生嵌合重復（嵌合比例約50%～60%），片段大小約18.0 Mb；②Yq11.222q11.23位置發(fā)生缺失，片段大小約7.8 Mb。

經(jīng)FISH檢測羊水中期細胞分裂相CEP18/X/Y著絲粒區(qū)域探針，共發(fā)現(xiàn)四種類型結果：（DXZ1×1，DYZ3×0，D18Z1×2）[36]；（DXZ1×1，DYZ3×4，D18Z1×2）[16]；（DXZ1×1，DYZ3×2，D18Z1×2）[14]；（DXZ1×1，DYZ3×1，D18Z1×2）[34]。見圖1。

G顯帶分析羊水細胞染色體發(fā)現(xiàn)存在五種不同核型即：mos 46，X，idic（Y）（q11.22）[34]；45，X[12]；46，X，del（Y）（q11.22）[5]；47，X，idic（Y）（q11.22）×2[5]；46，XY[44]，除45，X外其余四種核型涉及四種不同形態(tài)的Y染色體。見圖2。

3 討論

傳統(tǒng)的細胞遺傳學產(chǎn)前診斷是避免染色體異?；純撼錾闹匾侄?。隨著產(chǎn)前診斷技術的普及，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，羊水和絨毛培養(yǎng)中易出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象，這些嵌合體有些是真性嵌合，有些是假性嵌合，如何正確識別，如何正確進行相關遺傳咨詢，成為目前臨床關注的焦點之一。臨床上碰到的嵌合體多數(shù)為同源性嵌合體[2]，其又可分為真性嵌合體和假性嵌合體。真性嵌合體主要是由于細胞有絲分裂不分離或染色體丟失所致，也可能是因為有絲分裂后期染色單體的遲留，導致個別子細胞及其后代中少了一條染色體[3]。而假性嵌合體則可能是由于胎兒體外不重要細胞增殖、母體細胞污染、胎兒脫落細胞體外培養(yǎng)畸變或染色體制片中產(chǎn)生等。嵌合體胎兒的臨床表現(xiàn)，主要取決于異常核型所占比例，異常核型比例越高，臨床癥狀越明顯；相反，嵌合體中含正常核型越高，臨床表現(xiàn)越輕。一般認為，在羊水培養(yǎng)中胎兒真性嵌合體的發(fā)生率約為0.1%～0.3%，在絨毛培養(yǎng)中為0.8%。對于假性嵌合，可以通過CMA和FISH檢測技術進一步檢測予以排除[4]。

表1 染色體嵌合體相關結果及其妊娠結局

圖1 羊水中期細胞分裂相FISH檢測結果

圖2 羊水細胞染色體G顯帶核型

采用傳統(tǒng)的羊水細胞培養(yǎng)核型分析方法是檢測染色體結構重排的金標準，并能檢測染色體的非整倍體[5]，但在診斷染色體亞顯微小片段結構異常和復雜易位斷裂點時仍非常困難。CMA和FISH的應用能彌補傳統(tǒng)核型分析的不足，相互補充。

CMA是以微陣列技術為基礎的基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）分析技術，主要包括基于比較基因組雜交的微陣列（array-based comparative genomic hybridization，aCGH） 和基于單核苷酸多態(tài)性的微陣列（single nucleotide polymorphismarray，SNParray）[6]。CMA是一種高分辨率的全基因組染色體變異檢測技術，近年來其在臨床的應用逐步深入和廣泛。CMA技術檢測未培養(yǎng)細胞基因拷貝數(shù)變化，能夠檢測出染色體微小片段的缺失或重復，彌補傳統(tǒng)核型肉眼分辨率有限的不足。但其在聚合酶鏈反應（PCR）擴增階段存在優(yōu)勢擴增現(xiàn)象，會影響嵌合體病例中異常核型真實的嵌合比例，同時對于低比例嵌合體（嵌合比例小于20%）的檢出率也很有限。而且CMA技術對于復雜結構異常的病例，僅能提示基因拷貝數(shù)的變化，并不能直觀地確定其結構畸變類型及染色體空間結構變化。

FISH技術是利用熒光標記的特異性寡核苷酸片段作為探針，與染色體、細胞或組織中的核酸按照堿基互補配對原則進行雜交，通過熒光系統(tǒng)檢測，對待測DNA進行定性或相對定位分析[7]。相對于傳統(tǒng)的核型分析技術，F(xiàn)ISH技術具有快速及特異性高的優(yōu)點。更由于其直觀性，成為眾多遺傳學診斷技術的有效驗證方法，具有廣闊的應用前景，逐漸成為解決復雜的臨床細胞遺傳學問題的一種重要方法，是對經(jīng)典細胞遺傳學方法的補充[8]。FISH技術不僅可以直接檢測未培養(yǎng)羊水細胞間期細胞，對最常見的非整倍體作出快速的產(chǎn)前診斷，還可以對傳統(tǒng)羊水細胞核型分析懷疑異常的病例進行羊水中期細胞FISH檢測，以明確胎兒染色體結構異常的來源和準確定位斷裂點[9-10]。因此對于部分羊水核型少或懷疑嵌合的患者，取羊水或臍血等直接進行FISH檢測，不受細胞培養(yǎng)過程中選擇性生長的影響，可以更真實地反映胎兒體內(nèi)的細胞嵌合狀況，對于判斷胎兒預后會有更多幫助。目前英國臨床細胞遺傳協(xié)會已把采用間期細胞的FISH技術作為產(chǎn)前嵌合體檢查的篩查方法[11]。

本研究染色體嵌合體病例中，性染色體數(shù)目嵌合最常見（59%）。核型結果提示嵌合體的病例中，有近50%的病例CMA結果未檢測到嵌合現(xiàn)象，雖然FISH復查仍提示為嵌合體，但嵌合比例均在10%左右屬于低比例嵌合體，分析原因可能是CMA在檢測過程中需進行PCR擴增，從而改變了原有嵌合比例導致低比例嵌合體無法檢出。對于本研究中發(fā)現(xiàn)的2例多倍體嵌合體病例，其CMA和FISH結果均正常，為假性嵌合，不具臨床意義。因常染色體數(shù)目異常對胎兒生長發(fā)育影響較大，異常核型比例越高，胎兒可能預后越差，本研究中常染色體數(shù)目異常嵌合病例多選擇終止妊娠，僅1例20號三體低比例嵌合病例選擇繼續(xù)妊娠，需進一步隨訪生長發(fā)育情況。本研究中涉及3例染色體結構異常嵌合病例，且均為性染色體雙著絲粒染色體復雜結構嵌合，通過核型分析能夠直觀看到不同異常核型的形態(tài)，但無法確定異常核型來源；通過CMA結果提示性染色體拷貝數(shù)變化，異常核型來源可能為性染色體；進一步結合FISH技術檢測中期細胞性染色體著絲粒探針，可以明確雙著絲粒的存在及其在染色體上的位置。三種技術手段相互結合，相互補充，最終明確了異常染色體來源及其結構變異類型，給出更準確、更直觀的染色體核型變異結果。

繼續(xù)妊娠的嵌合體病例以性染色體數(shù)目嵌合為主，目前能夠隨訪到的妊娠結局均未表現(xiàn)出明顯的生長發(fā)育異常，電話隨訪家長都反映孩子沒有異常，外觀能見到是正常男性或女性，考慮性染色體嵌合體可能對患兒青春期發(fā)育以及后續(xù)生育產(chǎn)生影響，需繼續(xù)對這些病例進行隨訪至成年。這些患兒出生后均沒有再次復查核型，能夠出生后多組織復測核型當然可以更明確患兒的嵌合比例及嵌合現(xiàn)象分布情況，但臨床操作起來較難，一方面技術上目前我中心僅能檢測外周血核型，其他組織核型檢測尚未開展，另一方面相關標本的留取上也存在困難。

綜上所述，嵌合現(xiàn)象目前仍是遺傳咨詢中的一大難題。對羊水染色體分析中判定疑似嵌合體的病例，需采用多種方法加以驗證，不應急于終止妊娠，應充分應用CMA、FISH技術結合G顯帶核型結果進行綜合分析，并需要對胎兒形態(tài)進行細致的超聲評估。從而更加準確地確定嵌合類型以及異常核型的嵌合比例，為臨床醫(yī)師指導遺傳咨詢提供更加可靠的依據(jù)，既能避免正常妊娠的終止，也能保證出生人口的質(zhì)量。對于自愿保留嵌合體胎兒的患者，應充分告知胎兒可能的預后風險，因異常核型嵌合比例以及嵌合部位不同，對患兒生長發(fā)育的影響也不同，應密切關注胎兒出生后的生長發(fā)育情況，必要時重新檢測患兒不同組織染色體核型嵌合情況。