江紹鋒，趙 美，舒燦偉，周而勛*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.桂林醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541000）

【研究意義】水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起的水稻三大真菌病害之一，它是一種重要的土壤傳播的植物病原真菌病害。黑色素是植物病原真菌重要的毒力因子。生物體內(nèi)氨基酸是黑色素形成的主要前體物質(zhì)，不僅與形成的黑色素類(lèi)型和色素沉淀深淺密切相關(guān)，同時(shí)也影響到生物的健康狀況。氨基酸在水稻紋枯病菌黑色素形成中起著重要的作用，對(duì)水稻紋枯病菌防治具有潛在價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】氨基酸不僅是生物合成蛋白質(zhì)的重要原料，也是生物進(jìn)行正常生長(zhǎng)，維持生命的重要物質(zhì)組成基礎(chǔ)，生物調(diào)節(jié)自身新陳代謝的關(guān)鍵就是通過(guò)氨基酸相關(guān)代謝途徑合理的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)換[1]。某些氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸等）在相應(yīng)的氧化還原酶催化下發(fā)生棕色化反應(yīng)，形成對(duì)生物具有重要新陳代謝影響的吡嗪、吡咯和呋喃類(lèi)化合物[2-4]。苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶（phenylalamine hyolroxylase）的催化作用下引入羥基，由葉酸還原酶催化生成二氫生物喋呤，再通過(guò)輔酶（四氫生物嘌呤），在NADPH和H+存在的條件下還原為四氫化合物，苯丙氨酸羥化酶的催化反應(yīng)是不可逆的，不能夠由體內(nèi)酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼醄5]。酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下羥化合成多巴，然后多巴再經(jīng)氧化作用形成多巴醌，多巴醌進(jìn)一步通過(guò)環(huán)化和脫羧作用生成吲哚醌，最終進(jìn)入合成黑色素的代謝途徑。人和小鼠等動(dòng)物若缺乏酪氨酸酶，體內(nèi)黑色素合成代謝發(fā)生障礙，就會(huì)使皮膚、毛發(fā)變“白”，出現(xiàn)白化?。╝lbinism）[6-10]。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase）催化酪氨酸成為3，4-二羥基苯丙氨酸，又稱(chēng)為多巴（3，4-dihydroxyphenylalanineL，DOPA）。酪氨酸羥化酶也是通過(guò)以四氫生物喋呤為輔酶的單加氧酶，然后多巴在多巴脫羧酶的作用下催化生成多巴胺（dopamine）；多巴胺需要在多巴胺-β-氧化酶（dopamine-β-oxidase）的催化下使β-碳原子羥化，得到去甲腎上腺素（norepinephrine）；最終通過(guò)去甲腎上腺素甲基化合成腎上腺素（epinephrine）[11]。以上的多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素三者統(tǒng)稱(chēng)為兒茶酚胺（catecholamine）[12]。在黑色素細(xì)胞中，酪氨酸羥化酶是兒茶酚胺合成最重要的限速酶，同時(shí)會(huì)受到終產(chǎn)物的反饋調(diào)控。【本研究切入點(diǎn)】水稻紋枯病菌過(guò)氧化氫酶（RsCat）受到兒茶酚的負(fù)調(diào)控，隨著外源兒茶酚質(zhì)量濃度的升高，酶活力降低[13]；而兒茶酚是水稻紋枯病菌苯酚2-單加氧酶（RsPhm）催化的底物，在菌核和黑色素形成中起著重要的作用[14]。Abdelmotaal等[15]研究表明莨菪堿會(huì)引起稻瘟病菌和立枯絲核菌菌絲體電解質(zhì)的泄露，進(jìn)而抑制孢子萌發(fā)和附著胞的形成，400 μg/mL質(zhì)量濃度的莨菪堿使稻瘟病菌附著胞死亡率約為10%，而當(dāng)莨菪堿濃度為1 000 μg/mL時(shí)，附著胞死亡率高達(dá)70%。兒茶酚是一種抗氧化劑，有抗衰老和抗真菌的效果。實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基添加300 μg/mL質(zhì)量濃度的莨菪堿促進(jìn)紋枯病菌菌絲和菌核的生長(zhǎng)，而50 μg/mL質(zhì)量濃度的兒茶酚抑制紋枯病菌菌絲和菌核生長(zhǎng)，這兩種物質(zhì)對(duì)水稻紋枯病菌菌絲和菌核表型的影響明顯，是非常好的黑白表型對(duì)照[16]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)比較水稻紋枯病菌菌絲體和發(fā)酵液中的游離氨基酸含量和組成的差異，篩選可能與水稻紋枯病菌黑色素存在密切關(guān)聯(lián)的氨基酸，為進(jìn)一步揭示氨基酸在水稻紋枯病菌黑色素形成中的作用提供參考，對(duì)未來(lái)防治水稻紋枯病具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株信息和培養(yǎng)基

水稻紋枯病菌（R.solaniAG1-IA）GD-118來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室保存的強(qiáng)致病力菌株[17]。

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：葡萄糖20.0 g，馬鈴薯200.0 g，雙蒸水1 000.0 mL，瓊脂粉18.0 g；馬鈴薯液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：葡萄糖20.0 g，馬鈴薯200.0 g，雙蒸水1 000.0 mL。用高壓蒸汽滅菌鍋在121℃、105 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 主要儀器和試劑

氨基酸分析儀（日立L-8800型），氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 水稻紋枯病菌培養(yǎng)

從斜面平板上挑取水稻紋枯病菌（R.solaniAG1-IA）GD-118菌株在PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)2 d。

1.4 水稻紋枯病菌樣品的收集

利用打孔器（直徑5.0 mm）在生長(zhǎng)2 d菌齡的水稻紋枯病菌GD-118菌株的菌落邊沿對(duì)PDA培養(yǎng)基打孔，用滅菌的牙簽挑取菌絲塊，然后把10個(gè)菌絲塊轉(zhuǎn)移到含有終濃度為50 μg/mL質(zhì)量濃度的兒茶酚組（RsC），300 μg/mL質(zhì)量濃度的莨菪堿組（RsH）的150 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，對(duì)照組（Rs）不做任何處理（空白PDB）。接菌后，將3種處理的培養(yǎng)基置于搖床，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d后，用抽氣泵過(guò)濾，分別收集菌絲體和發(fā)酵液樣品，稱(chēng)量菌絲體的重量，然后用無(wú)菌水洗滌菌絲體2～3次，最后再用滅菌濾紙吸干菌絲體樣品表面多余的水分，菌絲體和發(fā)酵液樣品分別用于下一步的氨基酸分析。

1.5 樣品的前處理

將樣品分別定量后放入水解管中，往菌絲體的水解管中分別加入6 mol/L 10 mL鹽酸，5 mL發(fā)酵液的水解管中分別加入5 mL濃鹽酸（12 mol/L），然后接在真空泵抽氣管上，使水解管減壓后封口，再把封好的水解管放入恒溫干燥箱（110±1）℃進(jìn)行水解22 h后，拿出冷卻。打開(kāi)水解管，過(guò)濾，取出1 mL濾液，置于濃縮器中干燥，殘留物用1 mL去離子水溶解后蒸干，如此重復(fù)3次，再加入1 mL緩沖溶液（pH 2.2）混合溶解，最終由氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.6 氨基酸的定性和定量分析

根據(jù)GB/T18246—2000《飼料中氨基酸的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)中的測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)。氨基酸的定性應(yīng)用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。氨基酸定量利用建立外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量分析。氨基酸混標(biāo)液濃度為50 μmol/L，進(jìn)樣量為20 μL，重復(fù)3次，然后再按照每個(gè)氨基酸濃度和峰面積繪制氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中氨基酸的含量進(jìn)行定量。在相同的色譜條件下對(duì)水稻紋枯病菌菌絲體和發(fā)酵液樣品進(jìn)行定量分析。

1.7 檢測(cè)條件

柱溫：程序恒溫57℃；色譜柱：日立855-350型；反應(yīng)柱溫：135℃；檸檬酸（鈉）pH緩沖液梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：570 nm，440 nm；流速：洗脫泵0.40 mL/min，衍生泵0.35 mL/min；分析時(shí)間：59 min。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得數(shù)據(jù)利用SPSS Statistics 19.0軟件采用方差分析（ANOVA），采用LSD多重分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)都在5%的水平上進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻紋枯病菌菌絲體重量的分析

水稻紋枯病菌在28℃搖床振蕩培養(yǎng)3 d后，對(duì)照組的水稻紋枯病菌菌絲體重量與50 μg/mL質(zhì)量濃度的兒茶酚處理組沒(méi)有顯著差異，但與300 μg/mL質(zhì)量濃度的莨菪堿處理組有極顯著差異（圖1）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)氨基酸含量

通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀分析17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液色譜結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，標(biāo)準(zhǔn)液中各個(gè)氨基酸組分都有很好的分離。圖2A是用于檢測(cè)除Pro（脯氨酸）以外的其它16種氨基酸，吸收峰為570 nm，圖2B用于檢測(cè)Pro，吸收峰為440 nm。

通過(guò)氨基酸混標(biāo)液進(jìn)行分析，以氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，根據(jù)每個(gè)氨基酸出峰時(shí)間來(lái)判斷氨基酸種類(lèi)，以峰面積為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度，建立17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析結(jié)果如表1所示。

圖1 水稻紋枯病菌在不同培養(yǎng)條件下菌絲體重量的比較Fig.1 Comparison of mycelial weight of R.solani AG-1 IA under different cultural conditions

圖2 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸色譜Fig.2 Chromatogram of standard amino acids

2.3 菌絲體氨基酸含量與組成差異分析

水稻紋枯病菌菌絲體氨基酸含量與組成差異分析見(jiàn)表2。由表2可以看出，影響黑色素形成的前體物質(zhì)苯丙氨酸，在對(duì)照組和50 μg/mL質(zhì)量濃度的兒茶酚處理組中沒(méi)有顯著差異，但是在300 μg/mL質(zhì)量濃度的莨菪堿處理組中與對(duì)照組和兒茶酚處理組中都存在顯著差異，并且莨菪堿處理組的總氨基酸含量與對(duì)照組和兒茶酚處理組也存在顯著差異。而另一個(gè)影響黑色素形成的前體物質(zhì)酪氨酸，3種處理（組別）間的差異不顯著。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸和精氨酸共10種氨基酸在兒茶酚處理組和莨菪堿處理組存在顯著差異。在3種處理中，水稻紋枯病菌菌絲體天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸3種氨基酸含量相對(duì)比較豐富，分別達(dá)到了總氨基酸的9.44%，15.49%和9.61%，而甲硫氨酸占總氨基酸的含量最低，只有1.44%。

表2 水稻紋枯病菌菌絲體氨基酸組成分析Tab.2 Analysis of the amino acid composition of mycelia of R.solani AG-1 IA

2.4 發(fā)酵液氨基酸含量與組成差異分析

水稻紋枯病菌發(fā)酵液氨基酸含量與組成差異分析見(jiàn)表3。影響黑色素形成的前體物質(zhì)酪氨酸在對(duì)照組和50 μg/mL質(zhì)量濃度的兒茶酚處理組沒(méi)有顯著差異，但是300 μg/mL質(zhì)量濃度的莨菪堿處理組與對(duì)照組和兒茶酚處理組都存在顯著差異，另一種黑色素的前體物質(zhì)苯丙氨酸在3個(gè)組別間的差異不顯著，同時(shí)水稻紋枯病菌發(fā)酵液中其它11種氨基酸（賴(lài)氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、脯氨酸）也不存在顯著差異。在水稻紋枯病菌發(fā)酵液游離的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量相對(duì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它氨基酸含量，分別達(dá)到了總氨基酸的17.83%和58.21%，而苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸含量相對(duì)較低，不到總氨基酸的1%。水稻紋枯病菌發(fā)酵液中總氨基酸含量不存在顯著差異。

表3 水稻紋枯病菌發(fā)酵液氨基酸組成分析Tab.3 Analysis of amino acid composition in the fermentation broth of R.solani AG-1 IA

3 結(jié)論與討論

黑色素是植物病原真菌至關(guān)重要的毒力因子，而氨基酸是病原真菌黑色素形成的主要前體物質(zhì)，它不僅影響著黑色素的形成，同時(shí)也影響了生物的健康。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚可以促進(jìn)水稻紋枯病菌細(xì)胞壁的黑色素合成，進(jìn)而有助于水稻紋枯病菌侵染水稻組織。Jiang等[10]研究表明兒茶酚可以促進(jìn)水稻紋枯病菌黑化，同時(shí)也增強(qiáng)了水稻紋枯病菌對(duì)水稻的致病力。

通過(guò)對(duì)經(jīng)2種化學(xué)藥劑（莨菪堿和兒茶酚）處理后的水稻紋枯病菌的菌絲體和發(fā)酵液進(jìn)行氨基酸含量和組成差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲體和發(fā)酵液游離的氨基酸含量差異有很大的不同，發(fā)酵液的游離氨基酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)比水稻紋枯病菌菌絲體的氨基酸含量豐富。水稻紋枯病菌發(fā)酵液中各游離的氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸）含量存在不同程度的差異，而絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸等的差異相對(duì)較小。不管是水稻紋枯病菌菌絲體，還是發(fā)酵液，一般來(lái)說(shuō)對(duì)于同一種氨基酸，對(duì)照組和處理組之間同一種氨基酸含量比其它氨基酸含量的一致性高。在培養(yǎng)基上添加含硫氨基酸，如組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或酪氨酸等，水稻紋枯病菌會(huì)減少甚至不形成菌核[19]。

在水稻紋枯病菌菌絲體中天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸3種氨基酸含量相對(duì)比較豐富，分別達(dá)到了總氨基酸的9.44%，15.49%和9.61%，其中谷氨酸的含量最高，這與畢韻梅等[20]的研究結(jié)果一致。而水稻紋枯病菌發(fā)酵液中天冬氨酸和谷氨酸含量分別占到總氨基酸含量的17.83%和58.21%，結(jié)果表明不管是水稻紋枯病菌菌絲體還是發(fā)酵液都是谷氨酸和天冬氨酸最為豐富。谷氨酸作為生物體含量最大的一種氨基酸，小麥中的蛋白質(zhì)中谷氨酸含量為30%～35%，飲食中95%的谷氨酸是由腸道細(xì)胞代謝[21]。在果蠅中發(fā)現(xiàn)胞外的谷氨酸通過(guò)受體脫敏過(guò)程調(diào)節(jié)突觸谷氨酸受體，同時(shí)在伏隔核刺激代謝性的谷氨酸受體，進(jìn)而減少細(xì)胞外谷氨酸水平，這說(shuō)明細(xì)胞外的谷氨酸水平在生物體新陳代謝平衡系統(tǒng)中起著“內(nèi)分泌”的作用[22-23]。

莨菪堿是一種生物堿。在300 μg/mL質(zhì)量濃度的莨菪堿處理組中，影響水稻紋枯病菌菌絲體黑色素形成的前體物質(zhì)苯丙氨酸跟對(duì)照組和兒茶酚處理組都存在顯著差異，對(duì)照組和50 μg/mL質(zhì)量濃度兒茶酚處理組沒(méi)有顯著差異，而前體物質(zhì)酪氨酸在三者菌絲體比較中沒(méi)有顯著差異，可能的原因是苯丙氨酸羥化酶的催化反應(yīng)是不可逆，體內(nèi)的苯丙氨酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?，但是體內(nèi)酪氨酸不能夠轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼?。水稻紋枯病菌發(fā)酵液中對(duì)照組和50 μg/mL質(zhì)量濃度的兒茶酚處理組酪氨酸含量沒(méi)有顯著差異，但是300 μg/mL質(zhì)量濃度的莨菪堿處理組跟對(duì)照組和兒茶酚處理組酪氨酸含量都存在顯著差異，而苯丙氨酸在發(fā)酵液中不存在顯著差異。綜上，研究發(fā)現(xiàn)影響水稻紋枯病菌菌絲體和發(fā)酵液黑色素形成的氨基酸不同，在菌絲體中苯丙氨酸對(duì)黑色素形成更加重要，而在發(fā)酵液中，則是酪氨酸對(duì)黑色素形成更為關(guān)鍵，造成這些氨基酸差異的原因有待進(jìn)一步研究和探討，這為后續(xù)防治水稻紋枯病設(shè)計(jì)農(nóng)藥靶點(diǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。