宋漢娜 于佳寧 呂俊慧 陳露 林海燕

(1濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是臨床常見病、多發(fā)病，且有一定的癌變傾向。CAG常伴胃腺體萎縮、胃黏膜變薄，黏膜基層增厚或伴幽門腺化生和腸腺化生，是檢測(cè)轉(zhuǎn)變癌前病變的一個(gè)重要指標(biāo)〔1〕。CAG歸屬于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范疇。本研究所采用的萎胃康顆粒是以益氣養(yǎng)陰活血法立意組方的中藥制劑。萎胃康顆粒治療慢性萎縮性胃炎療效優(yōu)于維酶素，無(wú)明顯副作用，是治療CAG的良藥。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定蛋白激酶B(Akt)-鼠雙微基因(Mdm)2-P53信號(hào)通路上Akt、Mdm2、P53蛋白的表達(dá)研究萎胃康治療CAG的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，6周齡，體重(120±20)g，由山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。

1.2藥物與試劑 萎胃康顆粒由西洋參、白術(shù)、白芍、延胡索、三七、熊膽、延胡索、甘草等七味藥物組成。由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供。水楊酸鈉(批號(hào)：20181107)由北京Solarbio提供；維酶素片配成3 g/(kg·d)濃度的水溶液；兔抗Akt(批號(hào)：10176-2-AP)由美國(guó)proteintech公司提供；兔抗Mdm2(批號(hào)：AF0208)由Affinity公司提供；兔抗P53(批號(hào)：AF0979)為Affinity公司產(chǎn)品；抗鼠/兔通用型免疫組化試劑盒由proteintech公司提供。

1.3動(dòng)物分組及造模 健康雄性SD大鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、模型組、萎胃康高、中、低劑量組、西藥組各10只。模型組和藥物組按傳統(tǒng)造模方式〔2〕造模：以2%水楊酸鈉2 ml每天灌胃，前3 w正常飲食，后3 w單日禁食，雙日足量進(jìn)食，結(jié)合饑餓飽餐因素，共6 w成模。6 w后從空白組隨機(jī)抽取1只，造模各組各隨機(jī)抽取1只，做蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察胃黏膜組織形態(tài)變化，檢測(cè)造模是否成功。經(jīng)病理確認(rèn)造模成功后2 d開始灌胃治療。

1.4給藥方法 藥物組按萎胃康高劑量組〔3.00 g/(kg·d)〕、萎胃康中劑量組〔1.50 g/(kg·d)〕、萎胃康低劑量組〔0.75 g/(kg·d)〕分別灌胃給予不同濃度的萎胃康顆粒水溶液，空白組、模型組分別灌胃等量的生理鹽水，西藥組灌胃維酶素混懸液0.3 g/(kg·d)，1次/d，共30 d。固體飼料和水自由攝取。

1.5取材及標(biāo)本制備 在給藥30 d后，禁食24 h，2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔麻醉，打開腹腔，取全胃，沿胃大彎剪開，肉眼觀察整個(gè)胃的變化并拍照。后取胃竇部，切成兩部分，一部分4%多聚甲醛浸潤(rùn)固定12 h以上，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟后，石蠟包埋。

1.6檢測(cè)指標(biāo) 切片機(jī)上行厚度為5 μm連續(xù)冠狀切片4張，1張做HE染色，3張做免疫組化檢測(cè)。光鏡下觀察各組胃黏膜的病理變化；免疫組化法檢測(cè)各組胃黏膜Akt、Mdm2、P53蛋白的表達(dá)量，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用積分光密度(IOD)表示：400倍高倍鏡下，每張切片按同樣的光度隨機(jī)取5個(gè)視野，用Ipwin32圖片分析軟件測(cè)定IOD，5個(gè)視野的IOD平均值即為該張切片的蛋白表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組胃黏膜光鏡下觀察 正常組胃黏膜排列規(guī)則，胃黏膜厚，未發(fā)現(xiàn)腺體萎縮，模型組胃黏膜較薄，排列紊亂、稀疏，腺體萎縮，數(shù)目減少。治療后，其他治療組較模型組相比，腺體萎縮狀況都好轉(zhuǎn)，且萎胃康高劑量組恢復(fù)最明顯。

2.2萎胃康對(duì)CAG胃黏膜Akt和Mdm2蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組Akt和Mdm2的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與模型組相比，其余治療組Akt和Mdm2表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與萎胃康高劑量組相比，其余治療組Akt和Mdm2表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見圖1、2,表1。

2.3萎胃康對(duì)胃黏膜P53蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組胃黏膜P53表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，各治療組胃黏膜P53表達(dá)顯著升高(P<0.05)，其中萎胃康高劑量組p53表達(dá)升高最明顯，與其他治療組具有顯著性差異(P<0.05)。見圖3,表1。

圖1 各組胃黏膜Akt蛋白的表達(dá)(HE，×400)

圖2 各組胃黏膜Mdm2蛋白的表達(dá)(HE，×400)

圖3 各組胃黏膜P53蛋白的表達(dá)(HE，×400)

表1 各組胃黏膜Akt、Mdm2和P53表達(dá)的比較

與模型組相比：1)P<0.05；與高劑量組相比：2)P<0.05

3 討 論

CAG常表現(xiàn)為上腹部隱痛、脹滿、噯氣、食欲不振或消瘦、貧血等，無(wú)特異性〔3〕。CAG是多階段胃癌發(fā)生過(guò)程的中樞階段，因此了解其發(fā)生機(jī)制非常重要〔4〕。研究提出，CAG的主要原因是幽門螺桿菌感染〔5〕。CAG的病理表現(xiàn)是胃黏膜腺體的減少，胃腸上皮細(xì)胞的數(shù)量由細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡平衡維持〔6〕。

胃是水谷氣血之海，主腐熟水谷，胃氣具有向下運(yùn)動(dòng)以維持胃腸道通降下行的特性，有喜潤(rùn)而惡燥的生理特性。寒濕或燥邪易導(dǎo)致食欲不振，出現(xiàn)胃脘痛、不思飲食、胃脘食滯等癥狀。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為引起CAG的病因是多種多樣的，多由侵襲邪氣或飲食不調(diào)，勞倦太過(guò)及情志內(nèi)傷等導(dǎo)致中焦受阻，胃氣失和，脾氣虛弱不和，損傷肝氣，肝郁氣滯，胃失和降，膽汁反流入胃；或稟賦脾胃虛弱，不能治愈，就容易損傷絡(luò)脈，出現(xiàn)瘀血。CAG治療應(yīng)采取益氣養(yǎng)陰活血法。本研究所采用的萎胃康顆粒是以益氣養(yǎng)陰活血法立意組方的中藥制劑。方中西洋參甘微苦，性涼，補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津，屬于氣陰雙補(bǔ)藥，西洋參能益脾氣，滋脾陰，常用于脾氣陰兩虛之納呆食滯，口渴思飲，為方中君藥。白術(shù)甘苦，性溫，能益氣健脾、燥濕利水，白術(shù)主歸脾胃，以健脾、燥濕為主要作用，被譽(yù)為“脾臟補(bǔ)氣健脾第一要藥”，長(zhǎng)于補(bǔ)氣以復(fù)脾運(yùn)。白芍苦酸，性微寒，養(yǎng)血斂陰，還有止痛作用，可緩解胃脘疼痛。白術(shù)和白芍共為臣藥。延胡索活血行氣止痛，配白術(shù)和白芍可治中虛胃痛，三七具有化瘀止血，消腫定痛之功，可化胃絡(luò)瘀血和止痛，具有治療胃黏膜的萎縮性病變，預(yù)防腫瘤的藥理作用。熊膽可清熱解毒，清肝明目，治療胃炎等消化系統(tǒng)疾病。延胡索、三七、熊膽共為佐藥。甘草味甘，性平，能緩能和，調(diào)和諸藥而為使藥。

CAG是由多種原因引起的胃黏膜慢性炎癥性病變，發(fā)病過(guò)程中胃黏膜損害是主要的病理癥結(jié)。在細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)控中，Akt-Mdm2-P53信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用。Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，研究顯示，Akt以多種機(jī)制引起腫瘤的發(fā)生〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，Akt引起的腫瘤發(fā)生機(jī)制不僅是磷酸化，還可以解釋為Akt基因的增殖過(guò)度表達(dá)〔8〕。Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)典信號(hào)通路，以多種機(jī)制引起腫瘤發(fā)生。多種癌細(xì)胞(包括胃癌細(xì)胞)的惡性腫瘤化過(guò)程與Akt信號(hào)系統(tǒng)的異?；顒?dòng)增加有關(guān)〔9，10〕。Akt會(huì)磷酸化P53的抑制因子Mdm2，促進(jìn)Mdm2向核移動(dòng)，從而破壞P53的功能〔11〕。因此，Akt促進(jìn)腫瘤形成的作用是通過(guò)其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的位置來(lái)解釋的。Mdm2是一種癌基因，可在多種類型的腫瘤中過(guò)表達(dá)。Mdm2的表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織進(jìn)行免疫組化分析顯示胃癌組表現(xiàn)Mdm2蛋白陽(yáng)性檢出率為29.31%(17/58)，癌旁組織mdm2蛋白染色均為陰性，Mdm2蛋白過(guò)表達(dá)與胃癌發(fā)生有關(guān)〔13〕。Mdm2對(duì)P53蛋白的增殖、凋亡和活性化起到重要作用。Mdm2被稱為P53的主調(diào)節(jié)器。Mdm2是P53的催化劑，影響P53的生成、消失和功能。Mdm2基因有兩個(gè)催化劑，稱為P1和P2。細(xì)胞中活動(dòng)的P53蛋白與Mdm2 p2催化劑附近的P53-響應(yīng)元件(RE)結(jié)合，會(huì)誘發(fā)P2催化劑的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)〔14〕。當(dāng)P53過(guò)度表達(dá)時(shí)，Mdm2蛋白與P53結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄作用的功能，對(duì)P53起拮抗作用，并通過(guò)促進(jìn)P53蛋白促進(jìn)降解，從而使P53的濃度保持不變〔15〕。P53是一種抑癌基因，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞生長(zhǎng)衰老，并在基因受損時(shí)發(fā)揮重要作用〔16〕。當(dāng)基因受損或激活腫瘤基因時(shí)，P53腫瘤抑制基因被激活，促進(jìn)蛋白轉(zhuǎn)錄，并阻止細(xì)胞周期，修復(fù)受損基因，如果不能修復(fù)，就會(huì)消失〔17〕。在胃癌的分子生物學(xué)發(fā)生過(guò)程中，P53基因的消失、改變或功能的喪失起著相對(duì)重要的作用。超過(guò)60%的胃癌中發(fā)現(xiàn)P53基因的等位基因丟失，并且發(fā)現(xiàn)突變率在30%～50%〔18〕。研究表示，胃癌細(xì)胞系中正常P53基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以降低腫瘤生長(zhǎng)速度〔19〕，提示p53基因治療可以作為抗腫瘤治療方法。

本研究顯示，萎胃康能明顯改善大鼠胃黏膜萎縮的病理改變。Akt、Mdm2和P53蛋白對(duì)癌細(xì)胞生存起到重要的作用。CAG中Akt、Mdm2和P53的增加和降低是相互關(guān)聯(lián)的。在大鼠模型中Akt-Mdm2-P53信號(hào)通路誘發(fā)CAG癌前病變。因此，Akt、Mdm2和P53的細(xì)胞增殖和凋亡功能可能與CAG癌前病變有關(guān)。萎胃康治療CAG的機(jī)制可能與降低胃黏膜Akt、Mdm2蛋白表達(dá)和升高P53蛋白表達(dá)有關(guān)。