祁高展，劉紅娜，李貞子，龍玲，王明明

(西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

蘋果炭疽病是由蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起的，是蘋果生產中的主要病害之一。該病多發(fā)生在幼果期，具有潛伏侵染的特點，防治困難。目前，生產中多采用噴施化學藥劑的方法防治，但效果不理想，且病菌容易產生耐藥性，不符合現代農業(yè)生產的要求[1]。因此，開發(fā)新型天然殺菌劑用于蘋果炭疽病的無害化防治就成為必然趨勢。大蒜(AlliumsativmL.)是公認的天然植物廣譜抗菌材料，在農業(yè)生產領域，已有關于大蒜提取物控制農產品病害的研究報道。周清等[2]報道大蒜素對辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici(syd.)Butl.)和辣椒疫病病菌(PhytophthoracapsiciLeonian.)具有抑制活性；程智慧等[3]發(fā)現不同質量濃度的大蒜鱗莖粗提物對黃瓜枯萎病菌(Fusariumaxysporum(Schl.)f.sp.CucumerinumOwen.)具有抑制作用；宋衛(wèi)國等[4]報道，大蒜乙酸乙酯提取液和乙醇提取液對番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPer.)孢子萌發(fā)均具有抑制作用。但有關其具體的活性成分及各成分對蘋果炭疽病菌抑菌作用的研究未見報道。本研究通過大蒜鱗莖浸提液中活性成分分析及其對蘋果炭疽病抑菌作用的測定，為利用大蒜開發(fā)新型天然殺菌劑對蘋果炭疽病進行無害化防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料 大蒜(AlliumsativumL.)為市售新鮮民樂紫皮蒜，由當地農貿市場購買；蘋果炭疽病病原物由西北民族大學生命科學與工程學院實驗室提供?；钚猿煞只衔飿藴势酚砂⒎òＩ?Alfa Aesar)公司購得，分別為二烯丙基一硫化物(DAS)純度為98%；二烯丙基二硫化物(DADS)純度為80%；二烯丙基三硫化物(DATS)純度為80%；苯甲酸乙酯(ELB)純度為99%；二甲基二硫醚(DMDS)純度99%；鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)純度98.5%。

1.1.2 儀器 3-16L型離心機( 德國SIGMA公司)；RV 10 digital FLEX型旋轉蒸發(fā)儀 (德國IKA公司)；TRACE2000 GC-MS聯用儀(美國Finnigan公司)；MPLFLN-BD型物鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 病原物培養(yǎng) 將病原物活化，在無菌條件下由斜面接種到PDA平板中，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5 d，待菌落布滿平板后，用打孔器在菌落邊緣打取孔徑為8 mm菌碟，轉接在新的PDA培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.2 含化合物標準品培養(yǎng)基的制備 在無菌條件下，用甲醇分別將各化合物標準品配成質量濃度分別為5×103、1×104、2×105mg·mL-1的母液，將配好的母液和融化的PDA培養(yǎng)基按照體積比1∶100混合均勻后倒平板，制成質量濃度分別為50、100、200 mg·mL-1的帶藥平板，以加入等體積甲醇的PDA培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.3 大蒜鱗莖浸提液母液制備 參照廖靜靜等[5]的方法，取新鮮剝皮大蒜50 g，洗凈消毒，置研缽中勻漿，加入100 mL無菌水浸提4 h，過濾，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，經無菌過濾器(0.2 μm)過濾，制成質量濃度為0.5 g·mL-1的母液，保存?zhèn)溆谩Ｄ敢河孟嗤w積的二氯甲烷萃取3次，在旋轉蒸發(fā)儀上旋蒸至干，加入1 mL二氯甲烷定容，待GC-MS檢測。

1.2.4 大蒜鱗莖浸提液成分分析 用TRACE2000 GC-MS聯用儀對方法1.2.3制備的母液進行化學成分分析。色譜條件：色譜柱為DB21(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；初始柱溫為50 ℃，保持4 min，然后以5 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持5min；載氣為氦氣，流速為1 mL·min-1；進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL。質譜條件：EI電子轟擊源，電離能70 eV，離子源溫度250 ℃，溶劑延遲4 min，全掃描。

1.2.5 不同質量濃度化合物標準品對病原物菌絲生長的抑制作用 選用方法1.2.1中生長良好的PDA培養(yǎng)基，在無菌條件下用打孔器在菌落邊緣處打取直徑為8 mm的菌餅，放置在方法1.2.2制備的含不同質量濃度標準物的PDA培養(yǎng)基中央，每處理3皿，以加入等體積甲醇的PDA培養(yǎng)基為空白對照(CK)，25 ℃避光培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法量取菌落直徑，取平均值計算抑菌率。

抑菌率=((CK平均菌落直徑-處理平均菌落直徑)/CK平均菌落直徑)×100%。

1.2.6 不同質量濃度化合物標準品對病原物孢子萌發(fā)的抑制作用 參照孫廣宇等[6]的方法，用無菌水將病原物孢子洗脫并稀釋成106cfu·mL-1的孢子懸浮液，按1∶1體積比分別與不同質量濃度的化合物標準品溶液混和均勻，用移液槍移取30 μL混合液于載玻片上，將載玻片放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，以無菌水和孢子懸浮液混合液為空白對照(CK)，25 ℃避光培養(yǎng)，24 h后在40倍物鏡下(每個視野里35個孢子)(以孢子芽管的長度超過孢子直徑的一半為已萌發(fā)孢子)，每處理重復3次，取平均值計算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率=((CK平均孢子萌發(fā)數-處理平均孢子萌發(fā)數)/CK平均孢子萌發(fā)數)×100%。

1.3 數據分析

大蒜鱗莖浸提液GC-MS分析所得圖譜采用NIST(計算機檢索譜庫)確認各化學成分的名稱，采用面積歸一法[7]計算出各成分相對質量分數。

所得不同質量濃度化合物標準品對病原物菌絲生長和孢子萌發(fā)化感作用實驗數據用Excell2003和DPS9.5軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 大蒜鱗莖浸提液活性成分分析

利用GC-MS檢測到大蒜鱗莖浸提液中含有11種化學成分(圖1和表1)。其中，二烯丙基二硫化物含量為20.28%，二烯丙基三硫化物含量為15.96%，二甲基二硫醚含量為5.28%，苯甲酸乙酯含量為2.78%，鄰苯二甲酸二丁酯含量為2.48%，二烯丙基一硫化物含量為2.30%。其余化學成分含量較低，以含苯化合物和酯類化合物為主。

圖1 大蒜鱗莖浸提液氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatography of garlic bulb extract

表1 大蒜鱗莖浸提液活性成分Table 1 Active components of the garlic bulb extract

2.2 不同質量濃度化合物標準品對病原物菌絲生長的抑制作用

由表2可知，大蒜鱗莖浸提液的6種主要成分中，二烯丙基一硫化物、二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物、苯甲酸乙酯以及二甲基二硫醚對病原物菌絲生長具有抑制活性。其中，二烯丙基三硫化物和二甲基二硫醚抑制活性最強，兩者在質量濃度為100 mg·mL-1時對病原物菌絲生長的抑制率均達到了100%；而鄰苯二甲酸二丁酯則對病原物菌絲生長表現為低質量濃度促進和高質量濃度抑制作用。

2.3 不同質量濃度化合物標準品對病原物孢子萌發(fā)的抑制作用

不同質量濃度化合物標準品對病原物孢子萌發(fā)的抑制作用如表3所示。6種主要成分對病原物孢子萌發(fā)均具有抑制活性，其中二烯丙基三硫化物和二甲基二硫醚抑制活性最強，兩者在質量濃度為200 mg·mL-1時對病原物孢子萌發(fā)的抑制率均達到了100%。

表2 不同質量濃度化合物標準品對病原物菌絲生長的抑制作用Table 2 Inhibition of different concentrations standard compounds on pathogen mycelial growth

注：表中DATS為二烯丙基三硫化物，DADS為二烯丙基二硫化物，DBP鄰苯二甲酸二丁酯，ELB為苯甲酸乙酯，DMDS為二甲基二硫醚，DAS為二烯丙基一硫化物；數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05), 不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Notes: In this table DATS is Diallyl trisulfide,DADS is Diallyl disulfide,DBP is Dibutyl phthalate,ELB is Ethyl benzoate,DMDS is Dimethyl disulfide and DAS is Diallyl monosulfide;different lower-case and capital letters in the same column, respectively indicate the significant difference (P<0.05)and very significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 不同質量濃度化合物標準品對病原物孢子萌發(fā)的抑制作用Table 3 Inhibiton of different concentrations standard compounds on the germination of pathogen spores

3 結論與討論

經GC-MS檢測，大蒜鱗莖浸提液中主要含有6種活性成分，其對蘋果炭疽病菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有抑制活性。其中，二烯丙基三硫化物和二甲基二硫醚抑制活性最強。

大蒜鱗莖浸提液6種主要成分中，二烯丙基三硫化物、二甲基二硫醚、二烯丙基二硫化物以及二烯丙基一硫化物廣泛存在于蔥蒜類產品中，其對真菌、細菌等具有抑殺效應，是天然的抗菌物質[8]。如楊靜美等[9]報道，100 μL 和200 μL二甲基二硫醚處理對香蕉枯萎病菌的抑菌效果可達100%。含硫化合物抑菌作用的機理可能是通過氧化巰基，使與微生物生長繁殖相關的含硫巰基的酶失活，從而影響微生物生長繁殖，對病原物起到抑制或殺滅作用[10]。

鄰苯二甲酸二丁酯是一種植物源物質，在辣椒[11]、花生[12]、百合[13]、人參[14]的根系分泌物中均可分離鑒定出來，其對微生物生長具有抑制或促進作用。張文明等[15]研究發(fā)現，鄰苯二甲酸二丁酯可以明顯促進馬鈴薯立枯病病原物立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的生長。周寶利等[16]報道，0.5 mmol·L-1的鄰苯二甲酸二丁酯對茄子根際黃萎病菌的增殖具有較好的抑制作用。本研究結果表明，鄰苯二甲酸二丁酯對蘋果炭疽病菌絲生長具有低質量濃度促進高質量濃度抑制的作用，說明鄰苯二甲酸二丁酯可能作為一種外源物刺激了病原物菌絲的生長。

從植物資源所含的天然物質中篩選具有拮抗真菌病害的有效成分，對于發(fā)現先導化合物，尋找與開發(fā)天然殺菌劑對病害進行無害化防治具有重要意義。植物中的許多天然活性成分具有抗菌作用，這些成分在抵御病原物侵染中具有潛在的生理功能，但一般來說，植物資源中的活性成分表現出的抗菌作用是多種化合物協(xié)同作用的結果[17-20]。