李雷，王海燕，陶尚玉，陳夢(mèng)微，龍星雨，夏惠，祝進(jìn)，鄧群仙*，周瓊

基于果實(shí)品質(zhì)性狀和SSR標(biāo)記的李種質(zhì)資源聚類

李雷1,2，王海燕1，陶尚玉1，陳夢(mèng)微1，龍星雨1，夏惠3，祝進(jìn)4，鄧群仙1*，周瓊5

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2.達(dá)州市茶果技術(shù)推廣站，四川 達(dá)州 635000；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，四川 成都 611130；4.四川省園藝作物技術(shù)推廣總站，四川 成都 611041；5.漢源縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 漢源 625300)

采用25個(gè)果實(shí)性狀指標(biāo)和19對(duì)SSR引物對(duì)四川栽培的19份李種質(zhì)資源進(jìn)行主成分分析和聚類分析，并以歐式距離、前3個(gè)主成分和遺傳相似性為基礎(chǔ)，分別作系統(tǒng)聚類、三維排序圖和UPGMA聚類。結(jié)果表明：19份李種質(zhì)25個(gè)果實(shí)性狀指標(biāo)的平均變異系數(shù)為54.71%，其中果皮紅綠色差值a值的變異系數(shù)最大，為436.14%，果核側(cè)徑的變異系數(shù)最小，為9.99%；系統(tǒng)聚類可將李果實(shí)分為深色系大果型和淺色系小果型；主成分分析中，前3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為73.27%，第1主成分(果重因子)的貢獻(xiàn)率為49.45%，第2主成分(果形與色澤因子)的貢獻(xiàn)率為14.21%，第3主成分(營(yíng)養(yǎng)因子)的貢獻(xiàn)率為9.62%；以主成分PC1、PC2和PC3向量為軸的三維排序圖清晰地展示出各種質(zhì)在果實(shí)性狀上的相對(duì)差異；SSR標(biāo)記顯示供試材料的遺傳多樣性豐富，UPGMA聚類與系統(tǒng)聚類和主成分三維排序的結(jié)果基本一致。

李；果實(shí)性狀；微衛(wèi)星標(biāo)記；聚類分析

李為薔薇科(Rosaceae)、李亞科(Prunoideae)、李屬()植物[1]，李果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，是重要的夏季鮮食水果。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2016年，中國(guó)李收獲面積和產(chǎn)量分別為198.57 萬hm2和679.20 萬t，收獲面積和總產(chǎn)量分別占全球的75.81%和57.76%，是全球第一大生產(chǎn)國(guó)[2]。四川李種質(zhì)資源豐富，2017年栽培面積超過7 萬hm2，受生態(tài)環(huán)境和消費(fèi)因素的限制，使得對(duì)李的選育帶有明顯的傾向性，近年來選育的‘脆蜜李’‘巴山脆李’‘羌脆李’等品種均為脆李類型，但長(zhǎng)此以往可能會(huì)導(dǎo)致育成品種的遺傳背景較為單一化。在長(zhǎng)期的引種栽培和人工選擇過程中，四川李種質(zhì)可能發(fā)生遺傳變異，對(duì)這些品種的正確鑒別和果實(shí)性狀的評(píng)價(jià)，了解品種間的遺傳變異和多樣性，是四川李種質(zhì)資源開發(fā)利用和育種改良的重要前提。

有研究發(fā)現(xiàn)表型差異與遺傳差異之間沒有必然的關(guān)系[3]。主成分和聚類分析具有直觀反映作物品種資源間的遺傳差異及類群性狀的特點(diǎn)[4]，在楊梅[5]、蘋果[6]、核桃[7]等果樹品種資源和遺傳育種中被廣泛使用。農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)在一定程度上容易受環(huán)境和觀察者專業(yè)能力的影響，將反映表型差異的農(nóng)藝性狀標(biāo)記與反映遺傳差異的分子標(biāo)記相結(jié)合能夠提供更全面準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)[8–9]。筆者對(duì)在四川收集的19個(gè)李種質(zhì)的果實(shí)大小、色差值、色素含量及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等25個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)提取葉片DNA，基于果實(shí)品質(zhì)性狀及SSR標(biāo)記分析種質(zhì)的遺傳差異、類群特征和群體結(jié)構(gòu)，以期為四川李種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)和雜交親本選擇提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

19份李種質(zhì)資源(表1)，除茵紅李采自四川省江安縣桐梓鎮(zhèn)姜廟村(105°52′E，29°46′N，海拔高度378 m)外，其余材料均采自四川省漢源縣九襄鎮(zhèn)堰坪村(102°37′~102°40′E，29°29′~29°35′N，海拔高度1 233~1 362 m)。

表1　李種質(zhì)資源的基本信息

1.2　方法

1.2.1果實(shí)性狀測(cè)定

于果實(shí)達(dá)鮮食成熟期時(shí)，每個(gè)種質(zhì)選擇3株樹，在樹體東、南、西、北4個(gè)方向樹冠外圍結(jié)果枝上各摘取5個(gè)著色良好、果形正常的果實(shí)，用電子天平測(cè)定果實(shí)和果核質(zhì)量；用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)定果實(shí)與果核的縱徑、橫徑和側(cè)徑；用GY–4型數(shù)顯硬度計(jì)測(cè)定果實(shí)硬度；用CM–2500d型分光測(cè)色計(jì)(Konica Minolta，日本)測(cè)定果實(shí)赤道部位果皮和果肉的色澤明亮度L、紅綠色差值a和黃藍(lán)色差值b。用WYT–1型手持折光儀測(cè)定李果實(shí)可溶性固形物含量；用蒽酮比色法[10]測(cè)定果肉可溶性糖含量；用氫氧化鈉滴定法測(cè)定果肉可滴定酸含量；用Fe3+還原法[11]測(cè)定果肉抗壞血酸含量；用80%丙酮浸提法[10]測(cè)定果皮和果肉葉綠素與類胡蘿卜素含量；用亞硝酸鈉–硝酸鋁比色法[12]測(cè)定果皮和果肉類黃酮含量。

1.2.2SSR標(biāo)記分析

于初春采集果樹新梢嫩葉，采用改良CTAB法[13]提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，使用Nanodrop one微量紫外–可見光分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定濃度后，稀釋至20 ng/μL，用于PCR擴(kuò)增。從合成的87對(duì)引物中篩選出多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定的19對(duì)引物[14–19]，用于SSR標(biāo)記分析，用聚丙烯酰胺凝膠銀然法進(jìn)行條帶檢測(cè)。

1.3　數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn)行Duncan法方差分析；將數(shù)據(jù)進(jìn)行Z–分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)化后，采用Ward法和歐式距離進(jìn)行系統(tǒng)聚類；使用OmicShare(http://www. omicshare.com/tools)繪制三維排序圖；聚丙烯酰胺凝膠中清晰重復(fù)條帶記為“1”，同一位置無條帶記為“0”，構(gòu)建0/1矩陣，運(yùn)用POPGENE 1.32計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性；運(yùn)用NTSYS 2.10進(jìn)行非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類。

2　結(jié)果與分析

2.1　李種質(zhì)的果實(shí)性狀

由表2可知，李種質(zhì)資源25個(gè)果實(shí)性狀指標(biāo)中，果皮a值變異系數(shù)最大，為436.14%，果核側(cè)徑的變異系數(shù)最小，僅為9.99%；果皮葉綠素和類胡蘿卜素分別是色素含量指標(biāo)中變異系數(shù)最大和最小的，分別為71.62%和33.01%；抗壞血酸和可溶性固形物分別是果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)中變異系數(shù)最大和最小的，分別為61.20%和12.43%。整體來看，不同李種質(zhì)果實(shí)的可溶性固形物含量、可溶性糖含量、果肉L值、果實(shí)大小(縱徑、橫徑和側(cè)徑)和果核大小(縱徑、橫徑和側(cè)徑)的差異較小，變異系數(shù)低于20%。種質(zhì)間抗壞血酸含量、果皮a值、果皮b值、果肉a值、果皮葉綠素含量、果皮類黃酮含量和果肉葉綠素含量的差異較大，變異系數(shù)高于50%。從圖1可以看出，不同李種質(zhì)間果實(shí)色澤差異較大。不同李種質(zhì)果實(shí)性狀的差異主要是色差值與色素含量，果皮、果肉色差(*、*和*)和色素含量(葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮)的平均變異系數(shù)為178.05%、62.42%、51.74%和50.23%。值得注意的是，果皮和果肉值變異系數(shù)均高于L值的，*值的最小，表明果實(shí)的主要色差為紅綠色差。

圖1　李果實(shí)成熟期的色澤

2.2　基于果實(shí)性狀的系統(tǒng)聚類

基于李果實(shí)25個(gè)性狀指標(biāo)，對(duì)19份李種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果如圖2所示。李種質(zhì)可分為3個(gè)類群。G1類群包含8份種質(zhì)(秤砣李、黃石李、青菜李、麥泡李、青脆李(四川)、青脆李(云南)、四月合和茵紅李)，G1類群的果皮b值、果肉b值、果皮及果肉葉綠素含量均顯著高于G2和G3類群，而果皮a值、果皮b值、單果質(zhì)量、果實(shí)縱徑和果核質(zhì)量均顯著低于G2和G3類群(表3)。G1類群中，除茵紅李果皮有部分區(qū)域呈紅色外，其他種質(zhì)均為淺色系(黃綠色)，小果型。G2類群包含玉皇李、味帝和紫琥珀3個(gè)種質(zhì)，果肉L值、果肉b值和硬度均顯著低于G1和G3類群的。G3類群包含安哥諾弗萊索、黑寶石、黑布林、恐龍蛋、?李、?仔李和總統(tǒng)李等8個(gè)種質(zhì)，其果核質(zhì)量、果核側(cè)徑和果皮類黃酮含量均顯著高于G1和G2類群，除?李和?仔李外，另外6個(gè)種質(zhì)均為深色系(紫黑色)，大果型。

圖2　李種質(zhì)資源的系統(tǒng)聚類

表3　不同類群的李種質(zhì)果實(shí)性狀測(cè)定值

同一行數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(0.05)。

2.3　基于果實(shí)性狀主成分的三維排序

李果實(shí)性狀主成分分析的特征向量值列于表4。前5個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為49.45%、14.21%、9.62%、7.77%和4.95%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.01%。第一主成分(PC1)的特征值為12.36，主要與單果質(zhì)量和果實(shí)側(cè)徑相關(guān)，因此可以將第一主成分稱為果重因子。第二主成分(PC2)的特征值為3.55，主要與果肉L值、果實(shí)橫徑和果肉b值相關(guān)，可以稱為果形與色澤因子。第三主成分(PC3)的特征值為2.40，主要與可溶性固形物含量和可溶性糖含量相關(guān)，可以稱為營(yíng)養(yǎng)因子。第四主成分(PC4)的特征值為1.94，主要與抗壞血酸含量和果肉a值相關(guān)。第五主成分(PC5)的特征值為1.24，主要與可溶性糖含量和硬度相關(guān)，其中可溶性糖含量為負(fù)向因子。

表4　李果實(shí)性狀主成分分析的特征向量值

表4(續(xù))

利用前3個(gè)主成分繪制19份李種質(zhì)的三維排序圖(圖3)，PC1軸0點(diǎn)左側(cè)的群體較右側(cè)的群體更為分散，PC1軸上差異最大的是安哥諾與青菜李，PC2軸上差異最大的是安哥諾與味帝，PC3軸上差異最大的是?李與紫琥珀。

2.4　基于SSR標(biāo)記的李種質(zhì)資源多樣性和聚類

所選的19對(duì)引物均能擴(kuò)增出清晰整齊、多態(tài)性高的條帶，圖4為引物CPSCT034在19份李種質(zhì)中的擴(kuò)增結(jié)果。從表5可以看出，19對(duì)引物在19份種質(zhì)中擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最大值為9 (UDP96–010)，最小值為3(CPSCT044)，平均等位基因數(shù)為5.06；有效等位基因數(shù)最大值為6.45 (UDP96–010)，有效等位基因數(shù)平均值為3.43。Shannon’s信息指數(shù)的最大值為2.00(UDP96–010)，平均值為1.30。Nei’s基因多樣性的最大值為0.84(UDP96–010)，平均值為0.66。表明供試?yán)罘N質(zhì)的遺傳變異度較高，遺傳多樣性豐富。

基于SSR標(biāo)記的聚類如圖5所示，19份李種質(zhì)被分為3組，第1組(K1)包含6份種質(zhì)，其中安哥諾、弗萊索、黑寶石、黑布林、紫琥珀來自美國(guó)，總統(tǒng)李來自英國(guó)。第2組(K2)包含5份種質(zhì)(恐龍蛋李、?李、?仔李、玉皇李、味帝)，K21亞組包括2個(gè)來自福建的種質(zhì)(?李、?仔李)和2個(gè)美國(guó)種質(zhì)(恐龍蛋李、味帝)；玉皇李獨(dú)立成為K22亞組，這與玉皇李在G2類群中的聚類模式基本一致。第3組(K3)包含8個(gè)種質(zhì)(秤砣李、黃石李、青菜李、麥泡李、青脆李(四川)、青脆李(云南)、四月合、茵紅李)，與G1類群的8個(gè)種質(zhì)相同；K31亞組包含四川和云南的7個(gè)種質(zhì)，來自廣東的四月合獨(dú)立成為K32亞組。

M為DNA DL500 Maker；1~19為種質(zhì)編號(hào)。

表5　19份李種質(zhì)資源在19對(duì)引物中的遺傳多樣性指數(shù)

圖5　李種質(zhì)資源基于SSR標(biāo)記的UPGMA聚類

3　結(jié)論與討論

19份李種質(zhì)資源的25個(gè)果實(shí)性狀指標(biāo)的變異系數(shù)為9.99%~436.14%，平均值為54.71%，說明種質(zhì)間果實(shí)性狀差異極大，變異范圍較廣，多樣性豐富，這與前人在歐洲李[20]和中國(guó)李[21]中的研究結(jié)果基本一致。果實(shí)核型大小的變異度最小，與王美軍等[22]在刺葡萄中的研究結(jié)果一致。李果實(shí)色澤類型極為豐富，果皮彩色分6種類型，果肉色澤分8種類型[1]。果實(shí)色澤多被當(dāng)作描述型指標(biāo)，缺少定量數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)測(cè)定了果實(shí)色差和主要色素物質(zhì)含量，為李果實(shí)色澤評(píng)價(jià)提供了量化數(shù)據(jù)。果皮和果肉a值的變異系數(shù)分別為436.14%和153.80%，遠(yuǎn)高于其他指標(biāo)，除去果皮和果肉a值后感官指標(biāo)的平均變異系數(shù)僅為28.88%，此時(shí)平均變異最豐富的是色素含量指標(biāo)，這與果實(shí)a值變異系數(shù)較大相符合。本試驗(yàn)中的李種質(zhì)果實(shí)涵蓋了大部分的色澤類型，這可能是李種質(zhì)間果實(shí)a值差異較大的主要原因。

19份李種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)平均值低于孫萍等[23]對(duì)47份李種質(zhì)的研究結(jié)果，高于左力輝等[24]對(duì)24個(gè)不同產(chǎn)地中國(guó)李品種中的分析結(jié)果和孫莉莉等[25]在寒地李和杏中的研究結(jié)果，表明供試?yán)罘N質(zhì)具有中等至較高水平的遺傳多樣性。

與果實(shí)單果質(zhì)量和大小相關(guān)的性狀指標(biāo)被確定為第一主成分(PC1)，方差貢獻(xiàn)率高達(dá)49.45%，表明單果質(zhì)量對(duì)李果實(shí)的評(píng)價(jià)意義重大，這與前人對(duì)棗[26]、獼猴桃[27]和歐洲李[20]果實(shí)因子的評(píng)價(jià)基本一致，但與對(duì)蘋果[6]的研究差異較大，這可能與果樹種類及育種者對(duì)不同樹種果實(shí)性狀的關(guān)注度不同有關(guān)。大果、豐產(chǎn)是李重要的育種目標(biāo)，與果質(zhì)量、果形密切相關(guān)的指標(biāo)被提取成第一主成分因子，表明供試種質(zhì)存在較大的遺傳改良潛力。試驗(yàn)中，原產(chǎn)中國(guó)南方的李種質(zhì)果實(shí)普遍偏小，國(guó)外李種質(zhì)大果型較多，這與郁香荷等[21]的研究結(jié)果相似。根據(jù)劉文東[28]對(duì)李雜交子代遺傳規(guī)律的分析，小果型親本對(duì)后代果型影響極大，不宜作為選育大果型品種的親本；淺色系品種與深色系品種雜交，后代多表現(xiàn)為深色系，這種遺傳傾向在雜交親本選配時(shí)應(yīng)重點(diǎn)考慮。此外，以國(guó)外品種為主的類群在單果質(zhì)量、果實(shí)大小和類黃酮含量上均高于國(guó)內(nèi)品種類群，表明引種的國(guó)外品種可作為國(guó)內(nèi)李品種改良的材料。

本研究中，基于果實(shí)性狀的系統(tǒng)聚類和基于SSR標(biāo)記的UPGMA聚類呈現(xiàn)出相似的聚類模式，即大部分國(guó)內(nèi)品種、國(guó)外品種分別聚為一類，系統(tǒng)聚類中的G1類群和UPGMA聚類中K3組中的材料完全相同，8份材料均來自中國(guó)南方。以PC1、PC2和PC3為坐標(biāo)軸作三維排序，結(jié)果與系統(tǒng)聚類和UPGMA聚類基本一致，但更為直觀、形象。尤其是三維排序圖揭示了各品種在單果重、果形和色澤等方面的相對(duì)差異。三維排序圖顯示來自南方的李品種在空間分布較為集中，來自國(guó)外的李品種分布更為分散，這在一定程度上說明了南方李品種更為原始，國(guó)外李品種則有著更為豐富的多樣性[29]。

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Cluster analysis of plum germplasm resources based on fruit quality traits and SSR markers

LI Lei1,2, WANG Haiyan1, TAO Shangyu1, CHEN Mengwei1, LONG Xingyu1, XIA Hui3, ZHU Jin4, DENG Qunxian1*, ZHOU Qiong5

(1.College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan 611130, China; 2.Tea and Furit Technology Extension Station of Dazhou, Dazhou, Sichuan 635000, China; 3.Institute of Pomology and Olericulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan 611130, China; 4.Sichuan Horticultural Crop Technology Extension Station, Chengdu, Sichuan 611041, China; 5.Hanyuan County Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Hanyuan, Sichuan 625300, China)

Principal component analysis andcluster analysis of19 plum germplasm resources which planted in Sichuan were conducted using 25 fruit characters and 19 SSR markers. The plum germplasm were classified based on Euclidean distance, the first three principal components and genetic similarity, as well as systematic cluster, three-dimensional ordination plot and UPGMA clustering analysis. Results showed that the average coefficient of variation of the 25 fruit characters was 54.71%, the variation coefficient ofvalue of the peel was the highest (436.14%) and the variation coefficient of stone lateral dinmeter was the lowest (9.99%). The system clustering mainly divided these varieties into large fruit with deep color, small fruit with light color. In the principal component analysis, the first three principal components account for 73.27% of variation among the varieties, the first principal component (PC1) which regarded as fruit weight factor contributed 49.45%, the second principal component (PC2) as fruit shape and the color factor contributed 14.21%, and the third principal component (PC3) as nutritional factor contributed 9.62%. The three-dimensional ordination plot with PC1, PC2 and PC3 vectors clearly showed the relative differences of the main characters for the 19 plum germplasm resources. SSR markers showed that the genetic diversity of the tested materials was rich. The results of UPGMA clustering were similar to those of systematic clustering and three-dimensional ordination plot.

plum; fruit characters; simple sequence repeats makers; cluster analysis

10.13,331/j.cnki.jhau.2020.01.007

S662.302.3

A

1007-1032(2020)01-0038-10

2019–04–19

2019–12–06

四川省科技支撐項(xiàng)目(2013FZ0036)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“雙支計(jì)劃”基金項(xiàng)目(03572783)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)與四川省汶川縣校地合作項(xiàng)目(1922339018)

李雷(1993—)，男，四川平昌人，碩士研究生，主要從事果樹栽培與技術(shù)研究，sicaulilei@foxmail.com；

，鄧群仙，博士，教授，主要從事果樹栽培理論與技術(shù)研究，1324856299@qq.com

李雷，王海燕，陶尚玉，陳夢(mèng)微，龍星雨，夏惠，祝進(jìn)，鄧群仙，周瓊．基于果實(shí)品質(zhì)性狀和SSR標(biāo)記的李種質(zhì)資源聚類[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(1)：38–47．

LI Lei, WANG H Y, TAO S Y, CHEN M W, LONG X Y, XIA H, ZHU J, DENG Q X, ZHOU Q. Cluster analysis of plum germplasm resources based on fruit quality traits and SSR markers[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(1):38–47.

http://xb.hunau.edu.cn

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維