練小軍 朱開玲 張慶起 萬曉媛 謝國駟 郭程程 黃 倢

飼料添加益生菌對多病原陽性的凡納濱對蝦生長與存活的影響*

練小軍1,2朱開玲1張慶起3萬曉媛1謝國駟1郭程程1黃 倢1,2①

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗室 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；3. 連云港市啟明水產(chǎn)有限公司 連云港 222100)

采用假交替單胞菌(sp.) KL-3 2010和微小桿菌(sp.) KL-C2 2014作為益生菌，進(jìn)行凡納濱對蝦()投喂實(shí)驗，研究上述菌株對帶毒對蝦的生長與存活的影響。假交替單胞菌KL-3 2010對致急性肝胰腺壞死副溶血弧菌() (VPAHPND20130629002S01)有拮抗作用和胞外蛋白酶活性，微小桿菌KL-C2 2014有胞外蛋白酶活性。待試對蝦經(jīng)檢測為白斑綜合征病毒(WSSV)、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(VPAHPND)和蝦肝腸胞蟲(EHP)弱陽性。經(jīng)過為期60 d的養(yǎng)殖實(shí)驗，結(jié)果顯示，與投喂普通顆粒飼料的對照組相比，投喂假交替單胞菌KL-3 2010的對蝦存活率提高了213%±43% (<0.01)；投喂微小桿菌KL-C2 2014的對蝦平均生長率提高了105.5%±28.1% (<0.05)；交替投喂2株菌的對蝦存活率提高了184%±52% (<0.05)，平均生長率提高了70.6%±32.8%。腸道可培養(yǎng)優(yōu)勢菌研究表明，2株益生菌的投喂顯著影響了對蝦腸道優(yōu)勢菌群的種類。本研究為帶毒蝦苗的養(yǎng)殖提供一種有效的病害防控和促生長的手段。

凡納濱對蝦；益生菌；生長；存活；多病原帶毒

凡納濱對蝦()是我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)比重最大、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展程度最高的對蝦養(yǎng)殖種類。近年來，對蝦養(yǎng)殖業(yè)存在多種病原傳播，導(dǎo)致養(yǎng)殖中不斷出現(xiàn)急性或慢性死亡、生長停滯、攝食減少等，使養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展面臨嚴(yán)重的威脅(Crab, 2012; Bachère, 2000; Lafferty, 2015)。在應(yīng)對病害威脅中，養(yǎng)殖過程中的藥物濫用，影響了養(yǎng)殖產(chǎn)品安全，引起了社會的關(guān)注和憂慮，探索可持續(xù)的健康養(yǎng)殖模式成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的迫切需求。

益生菌為活體微生物制劑，可以促進(jìn)養(yǎng)殖動物的健康和生長，近年來，其應(yīng)用得到迅猛發(fā)展，受到廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖者的關(guān)注。益生菌的作用包括提供營養(yǎng)物質(zhì)、分泌分解酶促進(jìn)消化吸收、分泌拮抗物或爭奪生態(tài)位抑制有害微生物、降解養(yǎng)殖廢物改善水質(zhì)、激發(fā)機(jī)體的非特異性免疫提高抗病力等(樓丹等, 2009)，是一類可替代藥物的綠色飼料添加劑，在斑節(jié)對蝦()(Moriarty, 1998)、日本對蝦()(Zhao, 2012)和凡納濱對蝦(Ziaei-Nejada, 2006; 胡毅等,2008;Rengpipat, 2000; Lin, 2005; 王志杰等, 2015)、牙鲆()(王福強(qiáng)等, 2005)等的養(yǎng)殖中均獲得了較好的結(jié)果。

研究表明，假交替單胞菌(spp.)是海水養(yǎng)殖環(huán)境中經(jīng)常出現(xiàn)的一類細(xì)菌，該類細(xì)菌能夠分泌多種胞外的生物活性物質(zhì)，多具有抗細(xì)菌、抗真菌、溶藻等活性(Rodrigues, 2015; Isnansetyo, 2009; 梁靜娟等, 2014; 席宇等, 2005; Holmstr?m, 1998、1999; Bowman, 2007; Chen, 2010; Lucas-Elio, 2005)。微小桿菌(spp.)是農(nóng)業(yè)常用到的益生菌，主要用來殺滅土壤中的有害真菌(張瑩等, 2013; Selvakumar, 2009; Bharti, 2013; Dastager, 2010)，該類菌有較高的胞外蛋白酶活性，目前，沒有發(fā)現(xiàn)對動物或人類有致病作用，可以作為有益微生物。已有研究顯示，分離自海底沉積物中的微小桿菌SWJS2有金屬蛋白酶活性，所提取的蛋白酶對魚蛋白具有酶解活性((Lei, 2016; 趙謀明等, 2014)；海洋中分離的微小桿菌CFR26M能分泌胞外蛋白酶，同時，產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)(Kumar, 2014)。

前期研究中，作者分離鑒定到1株假交替單胞菌KL-3 2010和1株微小桿菌KL-C2 2014，確認(rèn)這2株菌對凡納濱對蝦沒有致病作用。本研究用上述 2株菌的菌液浸潤顆粒飼料后飼喂帶病原的凡納濱對蝦幼蝦，觀察對蝦的存活、生長、非特異性免疫力和腸道菌群的變化，以期為益生菌防控對蝦病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗對蝦 凡納濱對蝦于2016年8月28日購于江蘇連云港贛榆某對蝦養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)于自建的80 cm × 150 cm的室內(nèi)圓形水泥池中，平均體重為(0.42±0.02) g。

1.1.2 實(shí)驗用菌 假交替單胞菌KL-3 2010，2010年10月分離自山東昌邑健康大菱鲆()魚苗腸道，保存于–80℃冰箱；微小桿菌KL-C2 2014于2014年10月分離自江蘇贛榆對蝦養(yǎng)殖池塘的底泥，保存于–80℃冰箱；致急性肝胰腺壞死副溶血弧菌()VPAHPND20130629002S01、芽孢桿菌(sp.) KL-Y 2013、酵母菌(sp.) KL-5 2016均為本實(shí)驗室分離，保存于–80℃冰箱。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 實(shí)驗用菌制備 分別將冰箱保存的假交替單胞菌KL-3 2010和微小桿菌KL-C2 2014菌種復(fù)蘇，經(jīng)在2216E平板上劃線活化，挑取單菌落接種于2216E海水液體培養(yǎng)基，于28℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，采用涂布平板計數(shù)法確定菌濃度約為1011CFU/ml。

1.2.2 2株菌對VPAHPND20130629002S01的拮抗實(shí)驗

在2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)VPAHPND20130629002S01，取100 μl 1.0×107CFU/ml菌液涂布于新鮮的2216E固體培養(yǎng)基平板上，用無菌鑷子夾取5片6 mm的無菌濾紙片等距離放置在涂布VPAHPND20130629002S01的平板上，分別取8 μl假交替單胞菌KL-3 2010和微小桿菌KL-C2 2014的新鮮菌液滴于濾紙片上，28℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈。

1.2.3 2株菌的蛋白酶活性檢測 配制酪蛋白平板(Dang, 2009)，用無菌鑷子夾取4片6 mm無菌濾紙片在平板上等距離放置，分別取8 μl假交替單胞菌KL-3 2010和微小桿菌KL-C2 2014的新鮮菌液滴于濾紙片上，28℃培養(yǎng)24 h后觀察透明圈。用芽孢桿菌KL-Y 2013和酵母菌KL-5 2016作為對照菌株。

1.2.4 2株菌的生物安全性 取凡納濱對蝦270尾，設(shè)置對照組和2個實(shí)驗組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)均為30尾，養(yǎng)在10 L鹽度為20的海水中；實(shí)驗組水體分別加入新鮮的假交替單胞菌KL-3 2010和微小桿菌KL-C2 2014菌液，使終濃度為1.0×108CFU/ml，觀察72 h，記錄對蝦的活動及存活狀況。

1.2.5 實(shí)驗用飼料的制作 市售0號和1號對蝦顆粒飼料(正大集團(tuán)有限公司)，含35%蛋白，粒徑分別是0.5~1.0 mm和1.2 mm，室溫保存。以上飼料中以料液比1∶0.5 (/g∶/ml)添加假交替單胞菌KL-3 2010(P飼料)或微小桿菌KL-C2 2014(E飼料)菌液，使飼料中最終含菌量為1011CFU/g左右，室溫浸潤10 h作為實(shí)驗組用飼料。對照組飼料為按照料液比1∶0.5(/g∶/ml)將0號和1號顆粒飼料與無菌2216E液體培養(yǎng)基混合，于室溫浸潤10 h(C飼料)。

1.2.6 實(shí)驗對蝦的病原檢測 隨機(jī)取實(shí)驗對蝦30尾，分為2個樣品進(jìn)行合并檢測，使用無菌手術(shù)刀片切取對蝦肝胰腺、鰓絲和肌肉組織，放入95%乙醇(3倍體積)內(nèi)保存。送至實(shí)驗室后，使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根)和RNAiso Plus(TaKaRa)分別提取保存組織的總DNA和總RNA，分別按OIE (2016)和Tourtip等(2009)的方法對對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、蝦肝腸胞蟲(EHP)、致急性肝胰腺壞死副溶血弧菌(VPAHPND)、桃拉綜合征病毒(TSV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性肌壞死病毒(IMNV)和偷死野田村病毒(CMNV) (Zhang, 2014)進(jìn)行PCR檢測。

1.2.7 實(shí)驗分組及養(yǎng)殖管理 在江蘇贛榆某室內(nèi)對蝦養(yǎng)殖場隨機(jī)取實(shí)驗對蝦1680尾，分別置于12個80 cm ×150 cm的圓形水泥池，水體為0.5 m3，每個池子放置140尾。在正式分組飼喂開始之前，進(jìn)行15 d暫養(yǎng)，并在暫養(yǎng)期間取樣，對其可能攜帶的病原進(jìn)行檢測。

實(shí)驗設(shè)P組、E組、PE組和空白對照C組，每組3個平行。實(shí)驗對蝦每天投喂3次(07:00、13:00和19:00)，投喂量為對蝦體重的3%~5%(隨養(yǎng)殖時間而增加)。其中，C組投喂C飼料；P組以6 d為周期，前3 d投喂P飼料，后3 d投喂C飼料；E組以6 d為周期，前3 d投喂E飼料，后3 d投喂C飼料；PE組以6 d為周期，前3 d每餐等量交替投喂E飼料和P飼料，后3 d連續(xù)投喂C飼料。前30 d投喂0號飼料，后30 d投喂1號飼料，養(yǎng)殖實(shí)驗進(jìn)行60 d。每隔2 d換水1次，換水量約30%，水體溫度為(26±2)℃，鹽度為15±1，pH 8.1±0.1，連續(xù)充氣，每天檢查對蝦攝食及存活情況，及時取出死亡對蝦。

1.2.8 生長指標(biāo)測定 養(yǎng)殖過程中，每隔15 d每組每個重復(fù)取20尾，快速稱重后再放回原池，計算特定生長率；養(yǎng)殖結(jié)束時，記錄各組對蝦存活數(shù)量，測量各組對蝦初始和實(shí)驗結(jié)束時的體重，計算各組對蝦的存活率和生長率；統(tǒng)計各組對蝦飼料投喂量，計算飼料系數(shù)。

存活率(Survival rate, SR)(%)=存活尾數(shù)/總尾數(shù)×100

特定生長率(Specific growth rate, SGR)(%/d) =[(i+15)平均體重–T平均體重]/(T平均體重×15)×100

平均生長率(Average growth rate, AGR)(%/d)=(終末平均體重–初始平均體重)/(初始平均體重×60)×100

飼料系數(shù)(Feed conversion ratio, FCR)=攝食飼料量/(終末體重–初始體重)

1.2.9 腸道可培養(yǎng)優(yōu)勢菌分離鑒定 在養(yǎng)殖實(shí)驗的中后期(40、50和60 d)測定對蝦腸道細(xì)菌優(yōu)勢菌群。測定方法參考李繼秋等(2006)的方法，提前2 d從每組隨機(jī)取8尾蝦，置于新鮮海水中暫養(yǎng)，不投喂飼料，待排空腸道內(nèi)容物后，無菌操作取對蝦腸道，置于滅菌海水中清洗后勻漿，將腸道勻漿液梯度稀釋，將各稀釋度的腸道勻漿液涂布2216E平板，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取各組平板中的優(yōu)勢菌落，進(jìn)行分離純化培養(yǎng)。

按水煮法(唐曄盛等, 2002)提取DNA作為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(李筠等, 2006)；將產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.10 血淋巴取樣及血淋巴免疫相關(guān)指標(biāo)測定 養(yǎng)殖實(shí)驗結(jié)束后，對蝦饑餓24 h后，每池取10尾對蝦，用1 ml無菌注射器自對蝦圍心腔中抽取血淋巴，每組血淋巴液混合置于無菌離心管中，于4℃冰箱中靜置過夜，3000 r/min離心10 min，取上層血清，置于–80℃超低溫冰箱保存，待測。

酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和溶菌酶的活力以及總蛋白的濃度測定均采用測試盒(南京建成生物工程研究所)按說明書方法操作。其中，1個ACP活力單位為血清在37℃與底物作用30 min產(chǎn)生1 mg酚；1個SOD活力單位為反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%；1個POD活力單位為37℃條件下每分鐘催化產(chǎn)生1 μg的產(chǎn)物；溶菌酶活力單位為溶壁微球菌()在pH=6.4和37℃下經(jīng)30 min裂解使570 nm處光吸收值下降的比率(Hultmark, 1980)?？偟鞍诐舛雀鶕?jù)堿性條件下蛋白將Cu2+還原為Cu+后，與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，在562 nm處吸光度與已知濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)計算而得。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，<0.05為差異顯著，若差異顯著，則進(jìn)行Duncan多重比較，顯著性水平為<0.05。

2 結(jié)果

2.1 2株菌對VPAHPND 20130629002S01的拮抗作用

假交替單胞菌KL-3 2010和微小桿菌KL-C2 2014用濾紙片法貼附于VPAHPND20130629002S01涂布的平板，經(jīng)24 h培養(yǎng)后，觀察到KL-3 2010對VPAHPND20130629002S01具有拮抗作用，抑菌圈直徑為(10.42±0.23) mm，而KL-C2 2014對VPAHPND20130629002S01沒有顯示拮抗效果(圖1)。

2.2 2株菌的胞外蛋白酶活性

假交替單胞菌KL-3 2010和微小桿菌KL-C2 2014在酪蛋白平板上均能形成透明圈，對照菌株芽孢桿菌KL-Y 2013沒有觀察到透明圈，另一株對照菌株酵母菌KL-5 2016觀察到透明圈。表明2KL-3 2010和2KL-C2 2014均具有胞外蛋白酶活性(圖2)。

圖2 假交替單胞菌KL-3 2010和微小桿菌KL-C2 2014胞外蛋白酶活性

2.3 2株菌對凡納濱對蝦的生物安全性

分別用1.0×108CFU/ml的假交替單胞菌KL-3 2010和微小桿菌KL-C2 2014浸浴凡納濱對蝦72 h，未引起任何對蝦死亡和異常表征，表明這2株菌對凡納濱對蝦無致病性。

2.4 實(shí)驗用蝦病原檢測

實(shí)驗用凡納濱對蝦用PCR方法對多病原進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，所用蝦苗在第2輪PCR擴(kuò)增中檢出了VPAHPND、WSSV和EHP陽性，表明病原攜帶量較低，其中，WSSV和VPAHPND在2個合并樣品中均只有1個出現(xiàn)陽性，EHP在2個合并樣品中均出現(xiàn)了陽性；而IHHNV、TSV、YHV、IMNV和CMNV均為陰性(表1)。

表1 實(shí)驗用蝦多種病原檢測

Tab.1 Detection of multiple pathogens in experimental shrimp

注：nPCR：套式PCR；RT-nPCR：反轉(zhuǎn)錄套式PCR；P/2：套式PCR第二輪陽性；N：陰性

Note: nPCR: Nested PCR; RT-nPCR: Reverse-transcript nested PCR; P/2: Positive in the second run of nPCR; N: Negative

2.5 養(yǎng)殖過程中對蝦特定生長率的變化

每15 d進(jìn)行的特定生長率統(tǒng)計結(jié)果表明，投喂16~30 d各組對蝦的特定生長率比0~15 d的有所提升，但前30 d內(nèi)P、E和PE組對蝦的特定生長率與對照組相比沒有顯著差異(>0.05)；在第31~45天，對照組的特定生長率出現(xiàn)明顯下降，P組和PE組與16~30 d基本保持同一個水平，而E組顯著上升，各實(shí)驗組對蝦的生長速度顯著高于對照組(<0.05)；在第46~60天，各組生長速度有不同程度的下降，但P組和E組的特定生長率仍然維持在較高的水平，并顯著高于對照組(<0.05)(圖3)。

圖3 投喂添加不同益生菌飼料過程中各組對蝦特定生長率變化過程

C: 投喂對照商品飼料; P: 投喂添加假交替單胞菌 KL-3 2010飼料(P飼料); E: 投喂添加微小桿菌KL-C2 2014飼料(E飼料); PE: 間隔投喂P飼料和E飼料；標(biāo)注相同小寫字母表示無顯著差異(>0.05)，標(biāo)注不同小寫字母表示有顯著差異(<0.05)。下表同

C: fed with commercial feed; P: fed withsp. KL-3 2010 added feed (P feed); E: fed withsp. KL-C2 2014 added feed (E feed); PE: fed interruptedly with P feed and E feed. Columns marked with same lowercase mean no significant difference (>0.05); different lowercases mean significant difference (<0.05). The same as in following tables

2.6 實(shí)驗全程對蝦生長、存活及生產(chǎn)特性

養(yǎng)殖60 d后，對各組對蝦體重、存活率和飼料系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，對照組存活率僅為25.5%± 1.8%，而P組對蝦存活率達(dá)79.3%±7.6%，比對照組提高了213%±43% (<0.01)；PE組對蝦存活率為72.1%±10.1%，比對照組提高了184%±52% (<0.05)。對照組總平均生長率為(7.69±0.30)%/d；E組對蝦總平均生長率為(15.78±1.76)%/d，比對照組提高了105.5%± 28.1%(<0.05)；PE組對蝦總平均生長率為(13.10± 2.12)%/d，比對照組提高了70.6%±32.8% (<0.05)；P組對蝦總平均生長率為(11.16±0.71)%/d，比對照組提高了45.3%±12.5% (<0.05)。

各實(shí)驗組獲得的單位水體產(chǎn)量與對照組比有顯著差異(<0.05)(表2)。從高到低依次為PE組(702.5± 64.2)、P組(626.7±97.6)、E組(422.7±67.6)和C組(138.2±10.8) g/m3，分別是對照組的511%±71%、456%± 92%和308%±63%；E組、PE組和P組的飼料系數(shù)分別是對照組的68.6%±9.2%、73.0%±5.1%和76.3%± 1.0%，有顯著差異(<0.05)(表2)。

2.7 腸道定植的可培養(yǎng)優(yōu)勢菌檢測

養(yǎng)殖第40、50和60天時，取各組停喂2 d排空的對蝦腸道，進(jìn)行腸道內(nèi)定植的優(yōu)勢菌培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果顯示，益生菌添加的顆粒飼料長期投喂改變了腸道內(nèi)定植的優(yōu)勢菌群。在養(yǎng)殖40 d時，對照組對蝦的腸道中定植菌量最少，無明顯優(yōu)勢菌落，而P組腸道定植菌只有1株占絕對優(yōu)勢的副溶血弧菌，對該株副溶血弧菌進(jìn)行了A和B基因檢測，結(jié)果呈陰性，表明為非VPAHPND菌株；50 d時，P組腸道定植的優(yōu)勢菌除了副溶血弧菌還多了美人魚發(fā)光桿菌()，而E組和PE組腸道定植的優(yōu)勢菌則分別為施羅氏弧菌()和施瓦氏菌(sp.)，次優(yōu)勢菌為美人魚發(fā)光桿菌；在60 d時，對照組腸道定植有美人魚發(fā)光桿菌和副球菌(sp.)2株優(yōu)勢菌；而P組的腸道定植優(yōu)勢菌是微桿菌；E組和PE組腸道定植優(yōu)勢菌均為歐文斯弧菌()，且優(yōu)勢菌的密度要比對照組優(yōu)勢菌高2個數(shù)量級。其中，美人魚發(fā)光桿菌是對照組和實(shí)驗組都出現(xiàn)過的共同優(yōu)勢菌(表3)。

2.8 對蝦免疫指標(biāo)的變化

在養(yǎng)殖實(shí)驗結(jié)束后，對各組凡納濱對蝦血清免疫相關(guān)酶活力以及總蛋白濃度進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，P組和E組對蝦的血清ACP、SOD和POD明顯高于對照組(<0.05)；E組的ACP、POD、SOD和血清總蛋白濃度明顯高于對照組(<0.05)；但PE組除了SOD明顯高于對照組(<0.05)外，其他免疫指標(biāo)均低于對照組(表4)。

表2 投喂添加不同有益微生物飼料的凡納濱對蝦生長、存活和生產(chǎn)特性

Tab.2 Growth, survival, and production properties of L.vannamei fed with diets with different probiotics addition

注：標(biāo)注兩個相同的字母表示極顯著差異(<0.01)

Note: Duplicate lowercases mean very significant difference (<0.01)

表3 各實(shí)驗組對蝦腸道中定植的優(yōu)勢菌

Tab.3 Dominant bacteria colonized in midgut of the experimental shrimp

注：ND: 未測試 Note: ND: Not detected

表4 不同有益菌添加飼料對凡納濱對蝦免疫的影響

Tab.4 Effect of different dietary probiotics on immunity of L. vannamei

3 討論

病害為當(dāng)前對蝦養(yǎng)殖業(yè)面臨的主要問題之一。當(dāng)前，多數(shù)養(yǎng)殖者缺少病原檢測能力，使得攜帶病原的蝦苗大量進(jìn)入流通過程，給養(yǎng)殖者造成較大經(jīng)濟(jì)損失(黃倢等, 2016)。很多研究者開展的以健康蝦苗為對象的益生菌應(yīng)用報道中，對照組在存活率上不會受到實(shí)驗對象本身攜帶病原所帶來的死亡的影響，其對照組的存活率只略低于添加益生菌的實(shí)驗組(胡毅等, 2008; 劉泓宇等, 2014; 王軍等, 2015; 王玲等, 2011)，這種情況下，用存活率難以反映益生菌的應(yīng)用對蝦苗產(chǎn)生的保護(hù)效果。本研究在普通養(yǎng)殖場進(jìn)行，對該養(yǎng)殖場僅能獲得的凡納濱幼蝦檢出WSSV、VPAHPND和EHP病原弱陽性，反映了當(dāng)前生產(chǎn)中面臨的實(shí)際問題。在這種背景下，對照組在養(yǎng)殖中表現(xiàn)出很低的存活率，而益生菌添加組在生長和存活方面均獲得了顯著的正向效果，尤其是添加了假交替單胞菌KL-3 2010的P組和PE組，其存活率比對照組提高了約 2倍，這可能由于投喂的假交替單胞菌KL-3 2010可以分泌對VPAHPND有抑制作用的活性物質(zhì)，使得攜帶VPAHPND的蝦苗體內(nèi)的病原沒有機(jī)會繁殖暴發(fā)，從而獲得比對照組顯著提高的存活率。這為目前普遍攜帶VPAHPND的蝦苗養(yǎng)殖中益生菌的開發(fā)和應(yīng)用提供了更接近生產(chǎn)實(shí)際的實(shí)例。

已有研究表明，飼喂益生菌后，對蝦腸道消化酶活性得到提高，顯著促進(jìn)對蝦生長(Ziaei-Nejada, 2006; 胡毅等, 2008; 丁賢等, 2004)；飼料中添加單一益生菌或多種益生菌，均可在一定程度上改變對蝦腸道菌群而影響其消化，從而影響其生長特性(李桂英等, 2013)。本研究中，添加益生菌的實(shí)驗組生長率比對照組均顯著提高，尤其是添加了微小桿菌KL-C2 2014的實(shí)驗組，其特定生長率成倍提高，推測這一方面由于實(shí)驗對象攜帶可導(dǎo)致對蝦生長緩慢的EHP (劉珍等, 2016; 劉亞梅等, 2017)，而使對照組特定生長率從養(yǎng)殖中期開始出現(xiàn)顯著下降(圖3)；另一方面，由于實(shí)驗組投喂的2株益生菌分泌的胞外活性物質(zhì)，包括各種抗菌物質(zhì)和酶活性物質(zhì)，改變了對蝦腸道環(huán)境，直接或間接地影響了腸道菌群的組成，促進(jìn)了對蝦消化吸收，從而獲得了顯著提高的生長率。其中，添加微小桿菌KL-C2 2014的E組對蝦特定生長率在整個養(yǎng)殖過程中都保持上升趨勢(圖3)，直到養(yǎng)殖末期獲得最高的平均生長率(表2)，這可能與其分泌胞外蛋白酶和產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)有關(guān)(Kumar, 2014)，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。該結(jié)果提示以上2株益生菌的使用可以為目前普遍存在的EHP陽性蝦苗的生長難題提供一種可替代藥物的解決方案。

Tannock(1998)研究表明，對腸道環(huán)境遭到破壞的動物通過飼喂有益微生物可以重新建立宿主正常的微生物群落。本研究飼喂添加益生菌的飼料60 d后，對蝦腸道定植的可培養(yǎng)優(yōu)勢菌落中沒有檢測到所飼喂的2株益生菌，這可能是由于它們不適合對蝦腸道環(huán)境生長繁殖，在2 d的停喂排空后，被其他易在腸道中定植的菌群取代。但這2株益生菌分泌的某些胞外產(chǎn)物及菌體本身可能在長期投喂中改變了腸道內(nèi)環(huán)境，使得實(shí)驗組對蝦腸道定植的優(yōu)勢菌群與對照組相比產(chǎn)生顯著差異。該結(jié)果表明，外源添加益生菌即使不能在腸道內(nèi)優(yōu)勢定植，也可能通過改變宿主腸道環(huán)境而影響腸道定植的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象在其他一些對蝦益生菌的研究報道中也被證實(shí)(郝凱, 2013; 胡毅等, 2008; 李桂英等, 2013)。

益生菌具有良好的免疫刺激作用，其作用機(jī)理可能是通過細(xì)菌本身或細(xì)胞壁成分刺激非特異性免疫系統(tǒng)使其發(fā)揮作用，從而提高動物免疫力(Rengpipat2000; 雷質(zhì)文等, 2001; Stephensen, 1996; Thompson, 1995)。本研究中的P組和E組各項免疫指標(biāo)都高于對照組，而PE組免疫指標(biāo)除了SOD顯著高于對照組，其他免疫指標(biāo)都低于對照組(表4)，但其存活率和生長率卻顯著高于對照組并介于P組和E組之間。以上結(jié)果提示，本研究所檢測的幾項免疫指標(biāo)當(dāng)中，SOD的水平可能在對蝦抗病力和生長方面具有一定的指示性意義。

目前，對蝦益生菌飼料添加多使用芽孢桿菌并以健康蝦為對象，其實(shí)驗組對蝦在生長和存活方面與對照組相比都沒有顯著差異(胡毅等, 2008; 劉泓宇等, 2014; 王軍等, 2015; 王玲等, 2015)。本研究以攜帶病原的蝦苗為實(shí)驗對象，使用1株假交替單胞菌和1株微小桿菌添加飼料投喂60 d，實(shí)驗組獲得了極顯著的促生長和存活的效果，最終單位水體產(chǎn)量是對照組的3~5倍。其中，假交替單胞菌KL-3 2010主要與存活率的提高相關(guān)聯(lián)；微小桿菌KL-C2 2014主要與促生長相關(guān)聯(lián)。該結(jié)果可以為目前攜帶可導(dǎo)致死亡的VPAHPND和導(dǎo)致生長緩慢的EHP的蝦苗的養(yǎng)殖提供一種可替代藥物的病害防治措施。

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Effects of Probiotics-Supplemented Diets on the Growth and Survival ofCarrying Multiple Pathogens

LIAN Xiaojun1,2, ZHU Kailing1, ZHANG Qingqi3, WAN Xiaoyuan1, XIE Guosi1, GUO Chengcheng1, HUANG Jie1,2①

(1. Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity; Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao); Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Lianyungang Qiming Aquculture Ltd, Lianyungang 222100)

Current shrimp farming industries face difficulties associated with disease outbreak caused by pathogens on shrimp larva. The application of probiotics may provide a solution to problems associated with disease. We usedsp. strain KL-3 2010, which has antagonism against acute hepatopancreatic necrosis disease-causing(VPAHPND) and extracellular protease activity, andsp. strain KL-C2 2014, which has extracellular protease activity, as probiotics in a feeding test ofto investigate their effects on the growth and survival of shrimp. These two bacterial strains had no pathogenicity toin an immersion challenge at 108CFU/ml. Weak positive signals for white spot syndrome (WSSV), VPAHPND, and(EHP) were detected in the population of shrimp juveniles used in this study.was fed for 60 days withsp. KL-3 2010-supplemented diets (P group),sp. KL-C2 2014-supplemented diets (E group), alternation of the two diets (PE group), and normal diets (C group), respectively. Compared with the control group, the survival rate of the P group significantly improved (by 213%±43%;<0.01), the average growth rate of E group significantly increased (by 105.5%±28.1%;<0.05), and the survival rate and average growth rate of the PE group simultaneously improved (by 184%±52%;<0.05 and by 70.6%±32.8%, respectively). Feeding withsp.KL-3 2010 andsp. KL-C2 2014 diets significantly affected the species of dominant microflora colonizing the shrimp gut, but these added probiotic bacterial strains were not detected in the re-isolated and cultivated dominant bacteria colonies. The addition with these probiotics to diets significantly increased some serum immune indexes, such as superoxide dismutase. The study showed that diets supplemented with the above probiotics may provide a practical approach for disease prevention and growth promotion in shrimp farming, even for shrimp positive for multiple pathogens.

; Probiotics; Growth; Survival; Positive multiple pathogens

S963

A

2095-9869(2020)02-0121-10

黃 倢，研究員, E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn

2019-03-16,

2019-04-23

* 江蘇省蘇北科技專項(科技富民強(qiáng)縣)(BN2016058)、中國東盟海上合作基金(2016-2018)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗室鰲山科技創(chuàng)新項目(2015ASKJ02)、948計劃(2016-X56)和山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程專項共同資助 [This work was supported by the Special Fund for Subei Sci. & Tech. of Jiangsu Province (BN2016058), China ASEAN Maritime Cooperation Fund Project (2016-2018), China Agriculture Research System (CARS-47), Project of the Aoshan Sci. and Tech. Innovation Program of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02), 948 Program (2016-X56), and the Construction Program for Distinguished Taishan Scholars of Shandong Province of China]. 練小軍，E-mail: ronaldlj@163.com

10.19663/j.issn2095-9869.20190316001

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練小軍, 朱開玲, 張慶起, 萬曉媛, 謝國駟, 郭程程, 黃倢. 飼料添加益生菌對多病原陽性的凡納濱對蝦生長與存活的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(2): 121–130

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HUANG Jie, E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)