李海慶，孫勁松，馬 青，李作明，田玉富，周玉香*

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川 750021；3.寧夏農(nóng)墾小尾寒羊種羊有限公司，銀川 750021)

裂壺藻(Schizochytriumsp.)是一種原生生物，廣泛分布于海洋、河口等地區(qū)，其主要成分為脂肪、蛋白質(zhì)和糖，其中脂肪含量占干物質(zhì)重25%～50%，DHA含量占15%～20%[1]。裂壺藻油有類胡蘿卜素等多種天然抗氧化物質(zhì)，氧化穩(wěn)定性較高[2]。裂壺藻在肉羊上應(yīng)用較少，本試驗(yàn)擬采用體外培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)不同添加比例裂壺藻粉的日糧進(jìn)行體外批次發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定多項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)，用以評(píng)估確定裂壺藻粉在瘤胃發(fā)酵的最佳添加比例。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選用3月齡，體重在25 kg左右，體況良好的灘羊公羊3只，進(jìn)行瘤胃瘺管手術(shù)，待瘤胃瘺管固定后護(hù)理30 d開始試驗(yàn)。試驗(yàn)前，對(duì)圈舍進(jìn)行消毒，對(duì)羊只進(jìn)行驅(qū)蟲、健胃等管理。飼養(yǎng)日糧按照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T816-2004)合理配制營養(yǎng)全面的基礎(chǔ)日糧。基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)配方，見表1。每日飼喂2次，定量飼喂1230g，自由飲水。

稱取4.0 g精粗比為50∶50的日糧作為培養(yǎng)底物，日糧分別用裂壺藻粉按0%、1%、2%、3%比例替換玉米面，作為四個(gè)不同的處理組。添加0%組作為對(duì)照組。采用體外發(fā)酵技術(shù)，發(fā)酵開始0 h、3 h、6 h、12 h、24 h測(cè)得各點(diǎn)各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)處理點(diǎn)3個(gè)重復(fù)樣，最后所測(cè)值根據(jù)組合效應(yīng)綜合指數(shù)(MFAEI)的計(jì)算公式，整理數(shù)據(jù)。裂壺藻粉購自廈門匯盛生物有限公司，干物質(zhì)96%，粗蛋白26%，粗脂肪含量40%，DHA含量15%。

1.2 瘤胃液體外發(fā)酵

采用Menke等[3]發(fā)酵法進(jìn)行。試驗(yàn)期間在早飼前通過瘤胃瘺管抽取瘤胃液，取出后立即放入預(yù)熱39 ℃并通有CO2的保溫瓶中，帶回試驗(yàn)室。隨后經(jīng)8層紗布過濾后迅速分裝進(jìn)通有CO2的恒溫培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶裝入40 mL瘤胃液。培養(yǎng)液參照張愛忠[4]的方法進(jìn)行配制，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入80 mL培養(yǎng)液。試驗(yàn)前39 ℃預(yù)熱并通入CO2。取250 mL培養(yǎng)瓶，置于恒溫水浴搖床中，搖床溫度設(shè)置為39 ℃，搖速50次/min，記錄產(chǎn)氣量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

各試驗(yàn)點(diǎn)結(jié)束后，分別測(cè)定各組合的產(chǎn)氣量、pH、中性洗滌纖維(NDF)、氨態(tài)氮濃度(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量。

表1 基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)配方(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis)

注：預(yù)混料含量為(每kg不低于)：維生素A 224 000 IU，維生素D3100 000 IU，維生素E 700 mg，錳 1 200 mg，硒4.50mg，鋅1 900 mg，氯化鈉16%，鈣20%，磷4%。

Note:Premix contains (per kg no less than): VA 224 000 IU，VD3100 000 IU，VE 700 mg，Mn1 200 mg，Se 4.50 mg，Zn 1 900 mg，NaCI 16%，Ca 20%，P 4%.

發(fā)酵結(jié)束后從注射器讀取并記錄不同時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量。用PHS-2型酸度計(jì)直接測(cè)定培養(yǎng)瓶中的發(fā)酵液pH。NH3-N濃度參照馮恩慈等[5]的方法測(cè)定。NDF測(cè)定參照楊勝等[6]方法進(jìn)行。VFA用GC-2010氣相色譜儀測(cè)定。MCP測(cè)定用差速離心法，將細(xì)菌沉淀，再用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定[7]。

1.4 單項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)及多項(xiàng)組合效應(yīng)綜合指數(shù)

式中：A1為對(duì)照組各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)數(shù)值；A2為各組各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)數(shù)值；A3是在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)A2總和的平均數(shù)。多項(xiàng)組合綜合效應(yīng)指數(shù)(MFAEI)為各單項(xiàng)指標(biāo)的加和值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel記錄并作簡單處理后，用SAS 8.2軟件包中的ANOVA過程進(jìn)行方差分析，多重比較用Duncan法。試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例裂壺藻粉組對(duì)體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響

由表2可見，在日糧精粗比50∶50情況下，體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而有所增加。3 h、6 h時(shí)添加比例為3%組產(chǎn)氣量最大，對(duì)照組最小(P<0.05)。12 h時(shí)添加比例為3%組產(chǎn)氣量顯著高于其它三組(P<0.05)。24h時(shí)添加比例為2%組和添加比例為1%組值接近，顯著高于添加比例為3%組、對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 不同比例裂壺藻粉組對(duì)體外培養(yǎng)pH的影響

由表2可見，3 h添加比例為3%組最大，顯著高于其它三組。6 h添加比例為3%組最大，對(duì)照組最小，各組有顯著差異(P<0.05)。12 h對(duì)照組顯著小于其它組(P<0.05)。24 h添加比例為3%組最大，對(duì)照組最小(P<0.05)，添加比例為1%組、添加比例為2%組數(shù)值接近。

2.3 不同比例裂壺藻粉組對(duì)體外培養(yǎng)內(nèi)容物NDF消化率的影響

由表2可見，在3 h添加比例為3%組最大，對(duì)照組最小(P<0.05)；6 h對(duì)照組最小(P<0.05)，其它各組差異不大。12 h、24 h時(shí)添加比例為2%組顯著高于其它三組(P<0.05)。

2.4 不同比例裂壺藻粉組對(duì)體外培養(yǎng)氨態(tài)氮濃度的影響

不同比例裂壺藻粉組對(duì)體外培養(yǎng)氨態(tài)氮濃度的影響見表2。由表2可以看出，3 h時(shí)添加比例為3%組顯著高于其它三組(P<0.05)。6 h時(shí)各組差異不顯著。12 h時(shí)添加比例為2%組數(shù)值最大，添加比例為1%組最小，兩者差異顯著(P<0.05)。24 h時(shí)各組差異不顯著。

2.5 不同比例裂壺藻粉組對(duì)體外培養(yǎng)微生物蛋白含量的影響

由表2知，在3 h、24 h對(duì)照組最高，添加比例為3%組最小，兩者差異顯著(P<0.05)，其它各組間差異不顯著。在6 h添加比例為1%組最大，添加比例為3%組最小，兩者差異顯著(P<0.05)。在12 h各組差異不顯著。

2.6 不同比例裂壺藻粉組對(duì)體外培養(yǎng)揮發(fā)性脂肪酸的影響

由表2知，3 h時(shí)各組差異較小。6 h時(shí)添加比例為1%組最小，并且與對(duì)照組、添加比例為2%組、添加比例為3%組差異顯著(P<0.05)。12 h時(shí)添加比例為2%組VFA濃度高于對(duì)照組、添加比例為2%組、添加比例為3%組，差異不顯著。24 h時(shí)對(duì)照組VFA濃度最高，添加比例為3%組最低(P<0.05)。

表2 不同比例裂壺藻粉組對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響Table 2 Effects of different proportions of Schizochytrium sp. on gas production in vitro

注：同列大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Different capital letter superscripts in the same line mean highly significant difference (P<0.01), different small letter superscripts significant difference (P<0.05), the same letter superscripts insignificant difference (P>0.05).

2.7 不同比例裂壺藻粉組體外發(fā)酵指標(biāo)的綜合評(píng)定

在4種不同比例組合中，多項(xiàng)組合效應(yīng)綜合指數(shù)(MFAEI)結(jié)果，最高的組為添加比例為2%組，其它為添加比例為3%組和添加比例為1%組(表3)。

3 討 論

發(fā)酵的產(chǎn)氣量代表著飼料的營養(yǎng)價(jià)值，產(chǎn)氣量越高說明瘤胃微生物可代謝程度越高。Getachew等[8]用體外法試驗(yàn)，添加玉米油會(huì)提高產(chǎn)氣量。Machmüller等[9]報(bào)道，不飽和脂肪酸會(huì)抑制甲烷的生產(chǎn)，可能是產(chǎn)甲烷菌受到了影響。Busquet等[10]用體外法評(píng)估大蒜油對(duì)瘤胃液發(fā)酵指標(biāo)的影響發(fā)現(xiàn)，添加大蒜油降低了甲烷產(chǎn)量，并增加了丙酸鹽比例。本試驗(yàn)中添加比例為3%組在3、6、12 h的產(chǎn)氣量最大，發(fā)酵效果最好。添加比例為2%組在24 h時(shí)產(chǎn)氣量最高，在12 h時(shí)，僅次于添加比例為3%組。添加了裂壺藻粉組產(chǎn)氣量均比對(duì)照組高，可能裂壺藻粉的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分有益于瘤胃發(fā)酵。

Ueda等[11]、Benchaar等[12]報(bào)道奶牛日糧添加油脂對(duì)瘤胃pH沒有顯著影響。本試驗(yàn)經(jīng)過人工瘤胃發(fā)酵處理后的pH維持在3.74～6.67的范圍內(nèi)。各組隨著發(fā)酵時(shí)間延長，pH均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能為人工瘤胃無法排除代謝物，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，揮發(fā)性脂肪酸等代謝產(chǎn)品蓄積，導(dǎo)致pH下降。四組比較，對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH均低于其它各組，添加比例為2%組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH高于對(duì)照組，但低于其它2組。表明對(duì)照組和添加比例為2%組發(fā)酵產(chǎn)酸較多，可能發(fā)酵更加充分。

表3 不同比例裂壺藻粉組體外發(fā)酵指標(biāo)影響的綜合評(píng)定Table 3 Evaluation of fermentation index of Schizochytrium sp. in vitro by MFAEI

NDF消化率能反映瘤胃的消化率，瘤胃發(fā)酵越好，NDF消化率的值越高。Weld等[13]發(fā)現(xiàn)，給奶牛飼料添加脂肪不會(huì)影響瘤胃內(nèi)纖維的消化率。Patra[14]研究發(fā)現(xiàn)，給綿羊日糧中添加適量的脂肪不會(huì)影響纖維消化率，但脂肪添加量太高時(shí)，纖維消化率會(huì)下降。各組NDF的消化率均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。在12 h、24 h時(shí)添加比例為2%組顯著高于其它三組(P<0.05)。添加了裂壺藻粉的組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均比對(duì)照組的NDF消化率要高，說明裂壺藻粉可能有促進(jìn)瘤胃發(fā)酵的作用，且添加比例為2%組消化率最高。

瘤胃NH3-N濃度代表飼料蛋白質(zhì)被瘤胃微生物分解的速度及被代謝利用情況，Nolan等[15]發(fā)現(xiàn)瘤胃NH3-N濃度在6～30 mg/dL范圍內(nèi)比較合理。如果NH3-N升高,說明瘤胃微生物降解蛋白質(zhì)釋放NH3的速率超過了微生物利用NH3的速率,這會(huì)增加瘤胃氮循環(huán)中氮素的損失[14]。很多研究報(bào)道了飼喂植物油后反芻動(dòng)物的NH3-N變化，結(jié)果是增加、降低和沒有變化[16-17]。本試驗(yàn)中，在3 h和12 h時(shí)，添加比例為1%組的值最低。在6h、24 h各組并無顯著性差異，可能各組對(duì)飼料蛋白的降解速度非常接近，表明添加裂壺藻粉對(duì)瘤胃蛋白質(zhì)代謝的負(fù)面影響較小。

瘤胃內(nèi)微生物蛋白質(zhì)(MCP)的濃度是檢測(cè)微生物對(duì)NH3-N的利用率的重要指標(biāo)。飼料蛋白質(zhì)被瘤胃微生物降解為NH3,然后微生物又利用酮酸和NH3合成MCP。瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，能量和蛋白供應(yīng)充足、平衡，MCP產(chǎn)生量最大。Wolin等[18]報(bào)道，反芻動(dòng)物日糧添加油脂會(huì)降低短鏈脂肪酸，這些變化也可能與瘤胃微生物數(shù)量減少和蛋白水解減少有關(guān)。Hristo等[19]也發(fā)現(xiàn)，給育肥牛飼喂紅花油能顯著降低原蟲數(shù)量。在3、6、12 h，添加比例為1%組、添加比例為2%組的菌體蛋白含量和對(duì)照組相比差異不大。在各時(shí)間點(diǎn)，添加比例為3%組均為最小組。在24 h對(duì)組組最大，其它三組差異不顯著。綜合看，對(duì)照組和添加比例為1%組的菌體蛋白產(chǎn)量最高，有較理想的發(fā)酵效果。

VFA的產(chǎn)量也是評(píng)估瘤胃發(fā)酵能力的重要指標(biāo)之一。VFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是反芻動(dòng)物能量的主要來源。碳水化合物生成丙酸，粗纖維生成乙酸和丁酸。添加不飽和脂肪可能會(huì)改變瘤胃微生物，造成發(fā)酵模式的改變。Doreau等[20]報(bào)道反芻日糧中添加高油脂會(huì)對(duì)瘤胃微生物產(chǎn)生毒性，可以影響原蟲的數(shù)量，原蟲對(duì)于蛋白質(zhì)和纖維降解有著很大的作用。本試驗(yàn)中揮發(fā)性脂肪酸的含量隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的增長均呈上升的趨勢(shì)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在精粗比為50∶50的日糧條件下，裂壺藻粉在灘羊日糧中的適宜添加比例為2%。