鐘 珊 , 王小慶 ,馬保華, 鄒永德 , 廖新俤, 楊江鴻, 吳銀寶，2*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510642；3. 南海出入境檢驗檢疫局，廣東 佛山 528200)

磺胺類獸用抗生素在畜禽養(yǎng)殖中常作為飼料添加劑用以預(yù)防疾病和促生長，但由此也導(dǎo)致畜禽糞尿中磺胺類獸用抗生素殘留。在上海市多個養(yǎng)殖場采集到的糞便和土壤中，磺胺二甲嘧啶(SMZ)的檢出濃度范圍為1.29～8.01 mg/kg[1]。Pan等[2]在豬糞中也檢測到SMZ的濃度為28.7 mg/kg。由于獸用抗生素普遍具有廣譜抗菌性，其隨畜禽糞污進入?yún)捬跸到y(tǒng)就會影響厭氧消化系統(tǒng)的功能，同時還需要關(guān)注獸用抗生素的降解產(chǎn)物在厭氧消化系統(tǒng)中的殘留[3-4]。N4-ACE-SM2是SMZ在動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，它可以與SMZ一同隨動物的糞尿排泄到環(huán)境中，對環(huán)境造成潛在的威脅[5]。目前對于獸用抗生素對豬糞厭氧消化的影響研究多采用直接加入法[6-9]。已有研究表明，對于泰樂菌素和金霉素，在相同試驗條件下，體內(nèi)代謝法和直接加入法所得結(jié)果不同[10-11]。對于SMZ是否也存在類似結(jié)果，目前尚未有相關(guān)研究。由此，本研究經(jīng)體內(nèi)代謝法和直接加入法研究了SMZ對豬糞厭氧消化系統(tǒng)的影響，可為評價獸用抗生素對厭氧消化系統(tǒng)的影響及其生態(tài)毒理學效應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SMZ原料藥購自華南農(nóng)業(yè)大學華天獸藥廠，SMZ標準品購自中國標準物質(zhì)網(wǎng)。隨機選取30頭33 kg左右的長大二元雜母豬，預(yù)飼期為2周，日糧中不添加任何獸藥，臨床無異常后進入正式試驗期。正式試驗分為空白組和試驗組，每組15頭?？瞻捉M所飼喂飼料中不添加任何獸用抗生素；試驗組在飼料中添加SMZ，添加量為200 mg/kg飼料，首次量加倍，用藥期為7 d。收集用藥期內(nèi)空白組和試驗組的豬糞，經(jīng)檢測SMZ濃度和其代謝產(chǎn)物N4-ACE-SM2濃度后用于厭氧消化試驗。選取含SMZ最高和最低的豬糞用于厭氧消化試驗，以反應(yīng)生產(chǎn)實踐中SMZ在豬糞中的平均殘留水平。

1.2 試驗裝置

模型厭氧消化系統(tǒng)為有效容積1 300 mL的三口玻璃燒瓶[12]，三個出口均采用橡膠塞封嚴，頂部橡膠塞鉆出輸氣孔與吸收瓶相連，側(cè)邊出口分別用于取發(fā)酵液樣和加入新鮮豬糞樣。吸收瓶和集液瓶采用500 mL廣口瓶，吸收瓶用橡膠塞封口。吸收瓶橡膠塞上鉆孔連接玻璃和橡膠管路，用于導(dǎo)出厭氧消化所產(chǎn)生的氣體及吸收瓶中的液體。

1.3 試驗設(shè)計

厭氧消化試驗設(shè)4個試驗組和1個對照組，每組3個重復(fù)。試驗組依據(jù)兩種加入方式和兩種加入濃度分為4個處理組，兩種加入方式分別為經(jīng)體內(nèi)代謝組(即在飼料中添加SMZ經(jīng)體內(nèi)代謝后所收集的含SMZ和N4-ACE-SM2的豬糞)和直接加入組(即加入空白豬糞和相應(yīng)濃度SMZ)，兩種加入濃度分別為56.04 mg/kg 干豬糞(所獲豬糞中SMZ最高濃度)和47.10 mg/kg干豬糞(所獲豬糞中SMZ最低濃度)。經(jīng)檢測其代謝產(chǎn)物N4-ACE-SM2濃度分別為29.20 mg/kg 和17.80 mg/kg。試驗分組如表1所示。厭氧消化溫度設(shè)定為30 ℃。

正式厭氧消化試驗開始前，先在模型厭氧消化系統(tǒng)中加入固體率為10%的豬糞污水900 mL，接種100 mL成熟沼液，系統(tǒng)中剩余空間用氮氣填滿。待厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)氣穩(wěn)定后，開始進行正式試驗。

正式試驗時間為28 d，其中前7 d為加藥期，后21 d為停藥期，直至系統(tǒng)中檢測不出獸藥原形及其主要代謝產(chǎn)物殘留時停止試驗。每天8:00先從系統(tǒng)中取出100 mL混勻的沼液，然后CK組試驗全期每天均加入100 mL固體率為10%的空白豬糞污水；A1～B2組加藥期分別加入100 mL固體率為10%的含SMZ的豬糞污水，停藥期加入100 mL固體率為10%的空白豬糞污水。試驗期內(nèi)系統(tǒng)沼液總體積保持不變。

1.4 指標測定

1.4.1 SMZ和N4-ACE-SM2濃度 取10 mL沼液沼渣混合物，加入10 mL 0.01 mol/L Na2EDTA的Mcl-Vaine液，漩渦混合30s，超聲10 min，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，上清液倒入另一干凈離心管中，沉淀中加入5 mL提取液，重復(fù)上述步驟再次提取，混合兩次上清液，4 ℃ 13 000 r/min的速度離心5 min，取上清液過固相萃取小柱。固相萃取小柱先用1 mL甲醇激活，1 mL水平衡，然后將上清液過柱，使藥物吸附在萃取小柱上，加水3 mL清洗小柱，頂空1 min，然用0.5 mL甲醇和0.5 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫。洗脫液用0.22 μm濾膜過濾后，用于高效液相色譜儀檢測。

SMZ色譜條件：紫外檢測器，檢測波長275 nm；色譜柱采用Kromasil C18 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm，100 A)；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相為乙腈：5%冰醋酸(12:88)；流速1.0 mL/min；檢測限0.1 μg/mL；回收率75%。在上述檢測條件下，能將沼液沼渣中SMZ與其它物質(zhì)分開，其保留時間為15.250 min。

N4-ACE-SM2色譜條件：紫外檢測器，檢測波長262 nm；色譜柱采用Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，100 A)；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相，乙腈：0.5M磷酸氫二鉀=15：85；流速1.0 mL/min；檢測限0.1 μg/mL；回收率72%。在上述檢測條件下，能將沼液沼渣中N4-ACE-SM2與其它物質(zhì)分開，其保留時間為8.957 min。

1.4.2 產(chǎn)甲烷量 采用排水法計算甲烷產(chǎn)量[13]。

1.4.3 產(chǎn)甲烷菌多樣性 采用OMEGA 公司E.Z.N.A. Soil DNA Kit 試劑盒提取沼液沼渣中細菌基因組DNA，對其進行16S rDNA PCR擴增。引物對為：A934F 5'-AGG AAT TGG CGG GGG AGC A-3'和1390r 5'-ACG GGC GGT GTG TCA A-3')，其中在1390r的5'端加入33個GC夾(5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GGC GGG GGC ACG GGC GGT GTG TCA A-3')，以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定和片段的分離。所得PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并照像。采用BIO-RAD DCodeTM Universal Mutation Detection System(基因突變檢測系統(tǒng))對細菌PCR產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)分析。使用Quantity One軟件分析DGGE圖譜，并計算Shannon's多樣性指數(shù)H＇，計算公式為：

式中：H＇為Shannon's多樣性指數(shù)，H＇值越大說明樣品的多樣性程度越高；s為每個泳道條帶數(shù)；Pi為每個條帶強度占總條帶強度的比例。

利用Phroetix-1D(Totallb)和Phroetix-1D Pro(Totallb)軟件對DGGE電泳圖譜進行相似性分析，得到各個泳道間的相似性指數(shù)，即戴斯系數(shù)(Dice Coefficient，Cs)，根據(jù)Cs得到各個泳道相似性系數(shù)矩陣圖，用非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair Group Mean Average，UPGMA)將相似性系數(shù)矩陣轉(zhuǎn)化為相似性聚類樹狀圖，然后對聚類樹狀圖進行分析。在聚類樹狀圖中的Distance表示泳道間條帶差異性，當Distance為0時表示差異性為0，泳道間的條帶完全相同，當Distance為1時則相反，表示差異性為1，泳道間的條帶完全不同。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果用平均數(shù)±標準誤表示，采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，多重比較采用鄧肯極差檢驗法，顯著水平P值設(shè)為0.05，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMZ及N4-ACE-SM2濃度在厭氧消化系統(tǒng)中的變化規(guī)律

由表2可知，隨著含SMZ豬糞的加入，厭氧消化系統(tǒng)中SMZ濃度一直呈上升趨勢，這可能使由于厭氧消化系統(tǒng)對其的降解量小于系統(tǒng)中SMZ的加入量。7 d加藥期結(jié)束時，除CK組未檢出SMZ外，A1、B1、A2和B2組系統(tǒng)中SMZ的濃度分別為0.91、0.81、0.72、0.73 mg/L。進入停藥期后，系統(tǒng)中SMZ濃度快速下降，在停藥期第4天(試驗第11天)時，各試驗組SMZ濃度已經(jīng)降至加藥期結(jié)束時濃度的50%左右，但之后SMZ降解速度變緩，直至停藥期第21天(試驗第28天)時，各試驗組才檢測不出SMZ殘留，由于本研究采用動態(tài)進出樣，不斷有SMZ隨沼液沼渣排出到系統(tǒng)外，SMZ在系統(tǒng)中也被逐步降解，濃度下降。各試驗組系統(tǒng)中SMZ濃度差異不顯著(P>0.05)，且變化趨勢相同。

表2 厭氧消化系統(tǒng)中SMZ與N4-ACE-SM2的濃度變化Table 2 The concentration of SMZ and N4-ACE-SM2 in anaerobic digestion system mg/L

SMZ在豬體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為N4-ACE-SM2[5]，本研究測定了各試驗組厭氧消化系統(tǒng)中N4-ACE-SM2的濃度。由表2可知，在加藥期系統(tǒng)中N4-ACE-SM2濃度呈上升趨勢，這表明隨著含SMZ豬糞的加入，系統(tǒng)中N4-ACE-SM2濃度也逐步累積。進入停藥期后，厭氧消化系統(tǒng)中的N4-ACE-SM2濃度逐步下降，在試驗第25天，各試驗組厭氧消化系統(tǒng)中均未檢出N4-ACE-SM2殘留。B1組和B2組所用空白豬糞中不含N4-ACE-SM2，但系統(tǒng)中同樣檢測到該物質(zhì)，表明N4-ACE-SM2不僅可以經(jīng)體內(nèi)代謝產(chǎn)生，而且也可在厭氧消化系統(tǒng)中分解產(chǎn)生。方差分析表明，不論在加藥期、停藥期還是在整個試驗期，N4-ACE-SM2的濃度在各試驗組間差異不顯著(P>0.05)，濃度變化趨勢也相似。

2.2 SMZ對厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響

由表3可見，在試驗濃度條件下，加藥期A1、B1、A2和B2組分別與CK相比，系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量無顯著差異(P>0.05)。但采用經(jīng)體內(nèi)代謝法的A1組和A2組產(chǎn)甲烷量分別比同濃度的直接加入法的B1組和B2組顯著降低了17.36%和23.60%(P<0.05)。說明加藥期經(jīng)體內(nèi)代謝法抑制了產(chǎn)甲烷量。停藥期B1組和B2組產(chǎn)甲烷量顯著低于CK組、A1組和A2組(P<0.05)，B1組和B2組產(chǎn)甲烷量比A1組和A2組顯著降低了13.79%和16.34%。這說明停藥期直接加入法抑制了產(chǎn)甲烷量。

表3 SMZ對厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響Table 3 Effect of SMZ on the methane volume of anaerobic digestion system mL/d

注：同列肩注無相同字母者表示差異顯著(P<0.05)，有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note：In the same column, values with the different letter superscripts mean significant difference(P<0.05), same letter superscripts mean insignificant difference(P>0.05).

2.3 SMZ對厭氧消化中產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

2.3.1 產(chǎn)甲烷菌16SrDNA PCR擴增結(jié)果 分別在試驗第0、4、8、28天，采集5個試驗組沼液沼渣混合樣品提取微生物總DNA，并利用產(chǎn)甲烷菌的通用引物進行16S rDNA PCR擴增，擴增所得電泳圖如圖1所示。由圖1可知，所得PCR產(chǎn)物的分子量約為500 bp，片段大小與引物所能擴增的產(chǎn)物大小一致，初步鑒定是本試驗所需的目的片段。

2.3.2 產(chǎn)甲烷菌多樣性變化的DGGE分析 對所得PCR擴增產(chǎn)物進行DGGE分析可得圖2。圖2每個泳道中條帶數(shù)代表產(chǎn)甲烷菌的豐富度，每條帶明暗程度代表其所占比例大小。由圖2可知，在整個試驗過程中，產(chǎn)甲烷菌條帶數(shù)差異較小，但同一位置同種菌群在不同時期含量不同。

對DGGE圖譜分析并計算Shannon's多樣性指數(shù)H＇，從而對試驗開始時(第0天)、加藥期間(第4天)、加藥期結(jié)束時(第8天)和試驗結(jié)束時(第28天)的樣品進行產(chǎn)甲烷菌多樣性的對比。SMZ對厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H＇的影響如表4所示。第0天和第8天，各組間產(chǎn)甲烷古菌H＇變化無顯著差異(P>0.05)；在第4天和第28天，各試驗組的產(chǎn)甲烷菌H＇與CK組無顯著差異(P>0.05)，但加藥期第4天采用直接加入法的B1和B2組H＇顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝法的A1和A2組(P<0.05)；在試驗期結(jié)束時，B1和B2組H＇顯著低于CK組、A1組和A2組(P<0.05)。

選取圖2所示DGGE圖譜中標注的1-4條帶進行回收測序，將序列與Genbank進行比對，找到與其相似性最高的菌株，可得結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，試驗第4天，B2組出現(xiàn)條帶3(methanobacterium，產(chǎn)甲烷桿菌)，同時B1和B2組條帶1(uncultureal methnogenic，未培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷古菌)較其它試驗組亮，說明此時直接加入法的B1和B2組系統(tǒng)中出現(xiàn)產(chǎn)甲烷桿菌以及未培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷古菌數(shù)量增加，這可能解釋了加藥期直接加入組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H＇和產(chǎn)甲烷量均顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝組的原因。第8天時，僅在CK組中出現(xiàn)條帶4(methanobrevibacter sp，產(chǎn)甲烷短桿菌)，并且除CK組和A1組外，其余試驗組中均未出現(xiàn)條帶1。在試驗結(jié)束時，B1和B2組中條帶1和條帶3消失，條帶2(methanosaeta sp，產(chǎn)甲烷鬃毛菌)亮度減弱。而此時B1和B2組的H＇和產(chǎn)甲烷量均顯著低于經(jīng)體內(nèi)代謝組，這可能是由直接加入組產(chǎn)甲烷桿菌和未培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷古菌消失，以及產(chǎn)甲烷鬃毛菌數(shù)量減少造成的。

時間Time/d04828CK1.42±0.281.65ab±0.061.66±0.191.74b±0.09A11.46±0.361.51a±0.081.72±0.161.72b±0.05B11.47±0.341.72b±0.011.64±0.331.43a±0.21A21.43±0.321.58a±0.051.68±0.151.72b±0.14B21.48±0.171.75b±0.011.71±0.201.40a±0.16

表5 DGGE條帶測序BLAST比對結(jié)果Table 5 BLAST results of DGGE band sequences

由圖3可知，試驗開始時，各試驗組產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)一致，相似性水平為1。試驗第4天時，B2中產(chǎn)甲烷菌與其它試驗組相似性降低。第8天時，加入SMZ的試驗組產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)與CK組相比相似性進一步降低。在試驗結(jié)束時，A1和A2組中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)與CK組相似性為1，與B1和B2組相似性為0.86，說明采用兩種研究方法的試驗組間產(chǎn)甲烷菌群落出現(xiàn)差異。

3 討 論

3.1 SMZ及N4-ACE-SM2濃度在厭氧消化系統(tǒng)中的變化規(guī)律

SMZ在豬場廢水中降解方式以微生物降解為主，并且在厭氧條件下的降解速率高于好氧試驗組[14]。本研究在避光厭氧條件下進行，因此微生物降解可能是系統(tǒng)中SMZ濃度降低的主要原因。本研究在試驗濃度條件下，兩種研究方法并沒有顯著影響厭氧消化系統(tǒng)中SMZ的累積和降解速度；相同研究方法但加入不同濃度SMZ的試驗組間差異也不顯著，其原因可能是豬糞收集試驗所收集的豬糞中SMZ的最高濃度和最低濃度差異較小，分別為56.04 mg/kg和47.10 mg/kg，因此不同加入濃度間未表現(xiàn)出顯著差異。

雖然經(jīng)體內(nèi)代謝后含SMZ的豬糞中同時含有N4-ACE-SM2，而且其含量為其原形濃度的50%左右，但在厭氧消化系統(tǒng)中其濃度卻與直接加入組無顯著差異，說明與直接加入法相比，采用經(jīng)體內(nèi)代謝法時厭氧消化系統(tǒng)中N4-ACE-SM2的降解速度會更快。由于經(jīng)體內(nèi)代謝法中含有更多的N4-ACE-SM2，因此可能造成微生物對于N4-ACE-SM2的降解速度高于直接加入組[15]。研究表明，N4-ACE-SM2在廢水中的降解速度高于在無菌的超純水中，說明微生物對N4-ACE-SM2的降解起著重要作用[16]。采用經(jīng)體內(nèi)代謝法所用豬糞中同時含有SMZ和N4-ACE-SM2，但結(jié)果表明，兩種方法下SMZ和N4-ACE-SM2的濃度變化趨勢相似，且濃度無顯著差異。這可能是由于進入到系統(tǒng)中的N4-ACE-SM2并沒有影響其母體的降解速度，同時經(jīng)體內(nèi)代謝組可能有更多的N4-ACE-SM2，其降解速度也快于直接加入組。此外，高濃度SMZ經(jīng)體內(nèi)代謝的豬糞含有更多的代謝產(chǎn)物，可以增強獸藥對系統(tǒng)中微生物的抑制作用[15]，從而影響有機質(zhì)的分解速度和甲烷的產(chǎn)生。

3.2 SMZ對厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響

若抗生素初始濃度過高，會對厭氧消化系統(tǒng)中的微生物產(chǎn)生毒性，抑制微生物活性，造成甲烷產(chǎn)量下降[8,17]。有研究表明，當厭氧消化系統(tǒng)中磺胺甲惡唑的濃度在5～1 000 mg/L范圍內(nèi)，隨著磺胺甲惡唑濃度升高，對累積產(chǎn)甲烷量的抑制率也越高[18]。Loftin等[19]研究也表明，在厭氧消化系統(tǒng)中直接加入不同濃度的SMZ，結(jié)果顯示SMZ會抑制系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量。本研究表明，在停藥期直接加入法與對照組和經(jīng)體內(nèi)代謝法相比，抑制了產(chǎn)甲烷量，這與Loftin等[19]研究結(jié)果相似。但在加藥期，直接加入組產(chǎn)甲烷量顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝組，這可能是由于直接加入組在初始時僅加入了SMZ，而經(jīng)體內(nèi)代謝組同時含有同濃度的SMZ和一定濃度的代謝產(chǎn)物，二者共同影響厭氧消化系統(tǒng)中微生物的活性，可能造成了該時期經(jīng)體內(nèi)代謝組產(chǎn)甲烷量受到抑制。而停藥期直接加入組產(chǎn)甲烷量低于經(jīng)體內(nèi)代謝組，其原因可能是進入停藥期后，經(jīng)體內(nèi)代謝組厭氧系統(tǒng)中微生物已經(jīng)逐漸適應(yīng)系統(tǒng)環(huán)境，但直接加入組系統(tǒng)中微生物活性仍受到SMZ原形及其代謝產(chǎn)物的抑制[20]，從而使系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量下降。

于宸等[7]采用直接加入法探究SMZ對豬糞厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)氣量的影響，結(jié)果表明，在系統(tǒng)中添加30，60，120 mg/kg的SMZ，系統(tǒng)中SMZ濃度越高則促進越多產(chǎn)酸菌群的生長，從而合成更多的甲烷形成的前體物質(zhì)，以提高產(chǎn)甲烷量。該結(jié)果與本研究中采用直接加入法的B1組和B2組結(jié)果相似，本研究中B1組和B2組的產(chǎn)甲烷量在加藥期高于停藥期，而系統(tǒng)中SMZ濃度在加藥期也高于停藥期，說明SMZ濃度越高則系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量越高。但在經(jīng)體內(nèi)代謝組則得到不同的結(jié)果，說明飼料中的SMZ經(jīng)體內(nèi)代謝后對豬糞厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響與直接加入法不同，經(jīng)體內(nèi)代謝法能更準確評估豬糞中殘留SMZ對厭氧消化系統(tǒng)的影響。

3.3 SMZ對產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

本研究中，在厭氧消化系統(tǒng)中加入SMZ時，不同的研究方法對系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌H＇變化有顯著影響。加藥期采用直接加入法的產(chǎn)甲烷菌多樣性顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝法；而停藥期經(jīng)體內(nèi)代謝法的產(chǎn)甲烷菌多樣性顯著高于直接加入法。用直接加入法的產(chǎn)甲烷菌多樣性呈先增加后減少的趨勢，而用經(jīng)體內(nèi)代謝法的呈持續(xù)增加的趨勢，且與對照組趨勢相似。

有研究表明，采用直接加入法進行研究時，SMZ對豬糞厭氧消化過程中微生物群落功能多樣性的影響較大。錢金秋[6]發(fā)現(xiàn)，直接加入SMZ抑制了厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量，在試驗初期，添加SMZ的試驗組與對照組相比明顯降低了微生物群落的功能多樣性和物種豐富度，這可能是由于抗生素的外來加入抑制了參與發(fā)酵的微生物活性。這與本研究結(jié)果中相似，本研究中，停藥期直接加入組的產(chǎn)甲烷菌多樣性和產(chǎn)甲烷量均受到抑制。

此外，本研究采用經(jīng)體內(nèi)代謝法與空白組的產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高，而與直接加入法的相似性降低，因此經(jīng)體內(nèi)代謝法相比直接加入法能更準確反應(yīng)SMZ殘留對豬糞厭氧消化系統(tǒng)的影響，結(jié)果更貼近生產(chǎn)實踐。

4 結(jié) 論

在豬糞厭氧消化系統(tǒng)中，兩種研究方法對SMZ的累積和降解速度的影響無顯著差異，但采用經(jīng)體內(nèi)代謝法時N4-ACE-SM2的降解速度更快；加藥期時采用經(jīng)體內(nèi)代謝法顯著抑制了產(chǎn)甲烷量，而停藥期時采用直接加入法顯著抑制了產(chǎn)甲烷量；采用經(jīng)體內(nèi)代謝法的產(chǎn)甲烷菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與空白組具有更高的相似性。因此，采用經(jīng)體內(nèi)代謝法評估SMZ對豬糞厭氧消化系統(tǒng)的影響更具合理性，可獲得更準確的研究結(jié)果。