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(1.河北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071000；2.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000；3.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定071000)

20世紀80年代后，隨著大量外國瘦肉型豬品種的引進，我國地方豬群體規(guī)模急劇下降，品種數(shù)量不斷減少。比較1988年出版的《豬品種志》[1]和2010年出版的《中國畜禽遺傳資源志-豬志》[2]各地方品種群體規(guī)模的變化，大部分地方豬群體規(guī)模急劇下降。盡管近年來在優(yōu)質(zhì)特色產(chǎn)品的市場需求推動下，各地的地方豬都有較大程度的恢復，但這些群體都不可避免地受到瓶頸效應(yīng)的影響。開展遺傳多樣性研究，是對這些群體進行有效保護和合理開發(fā)利用不可缺少的基礎(chǔ)性工作。

深縣豬原產(chǎn)于深縣，主要分布在黑龍港流域，是黃淮海黑豬的一個地方類群。深縣豬是當?shù)貏趧尤嗣窠?jīng)過多年選育而成的地方良種豬，確切的形成無從稽考。據(jù)1978～1982年統(tǒng)計，深縣豬的群體規(guī)模有8萬余頭，占黃淮海黑豬40多萬頭的約18%[1]。但由于無計劃地引進國外品種豬，再加上市場廣泛引領(lǐng)作用下，純種的深縣豬逐步被淘汰。在多方努力下，通過搜集整理、提純復壯，到2014年，深縣豬的基礎(chǔ)母豬恢復到250余頭，次年通過了國家畜禽遺傳資源委員會品種認定，是一個典型的經(jīng)歷過瓶頸期的品種。

群體遺傳多樣性標志著群體的可持續(xù)發(fā)展?jié)摿Γ后w間遺傳多樣性的相似程度可以反映出群體間的起源聯(lián)系。線粒體DNA呈母系遺傳，其多樣性反映母系群體特征。線粒體基因組被認為是按照自身的進化速率發(fā)展的小型基因組，有效種群數(shù)量是核基因標記有效種群數(shù)量的1/4，分析較少的樣本量就可代表一個種群，具有分子結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快和易于測序及分析等特點，被廣泛地用于系統(tǒng)發(fā)生和群體進化研究的標記[3]。線粒體基因組中共有37基因，在編碼蛋白的13個基因中，ND1、ND4、ND5、Cytb和COI為進化速度較快的5個基因，其中以Cytb基因的應(yīng)用最為普遍。Gupta等[9]實驗證明，Cytb基因中421 bp片段的DNA序列可以對印度野豬和家豬這兩個亞種進行區(qū)分。通過對NJ樹的分析表明印度家豬不是印度野豬的后代，卻與歐洲和亞洲野豬有99%的相似度，這也與家豬的歐亞起源觀點相符。王繼英等[4]利用mtDNA CytB基因為標記，從分子水平探討 12 個豬種 166 個樣本(8 個山東省豬種，3個引進豬種和梅山豬種)的遺傳多樣性和各豬種間的親緣關(guān)系，研究結(jié)果表明山東豬種有共同的母系祖先，品種內(nèi)母系遺傳多樣性較貧乏CytB基因進化速率雖不及D-Loop區(qū)快，但一個較小的基因片段可包含從種內(nèi)到種間乃至到科間的進化遺傳信息,被廣泛認為是研究近緣物種間和種內(nèi)系統(tǒng)進化、遺傳分化程度和遺傳結(jié)構(gòu)等的重要指標。

胡英欣等[4]用7個微衛(wèi)星位點對深縣豬5個家系、70個種豬個體進行測定，檢測了深縣豬群體的遺傳多樣性，分析了該群體各公豬家系之間的遺傳距離。趙思思等[5]利用8個微衛(wèi)星標記對深縣豬40個種豬個體的遺傳多樣性進行了研究。但從線粒體基因組水平探究深縣豬遺傳多樣性的報道較少，目前為止，利用線粒體基因組中CytB基因?qū)ι羁h豬的分子進化方面的研究尚屬空白。

本研究以深縣豬為研究對象，對mtDNACytB基因全序列進行PCR擴增和序列測定，借以了解深縣豬豬種的遺傳資源狀況并闡明與其它豬種的親緣關(guān)系，可為該品種的有效保護及合理開發(fā)利用提供依據(jù)，同時對其它經(jīng)歷過瓶頸期的類似地方品種遺傳變異研究具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與DNA提取

試驗樣品采自辛集市某牧業(yè)有限公司，隨機采集深縣豬40頭豬只的耳組織樣，置于裝有1 mL 75%乙醇的EP管中帶回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Wizard基因組DNA純化試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；dNTP、Takara TaqTM Hot start Version購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)Genbank公布的豬mtDNA CytB基因的序列(序列號：AB015081.1)，應(yīng)用PCR引物設(shè)計的一般原則，使用Primer5.0軟件設(shè)計引物：上游引物：5'-ACCACGACCAATGAC-3'，下游引物:5'-CAGGGAATAGTTTAGTTAG-3',引物由北京華大基因研究中心合成。

1.4 PCR擴增與測序

深縣豬耳組織DNA參照基因組提取試劑盒說明書進行。PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL ，10 mM上下游引物0.5 μL，DNA模板1.25 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，加雙蒸水至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳純度檢測合格后送北京華大基因研究中心進行雙向測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果用SeqMan軟件處理得mtDNACytB基因全序列，應(yīng)用Bioedit軟件對測定的40頭豬樣本CytB基因全序列進行比對分析，對比結(jié)果使用Dnasp5.0軟件計算單倍型數(shù)(number of haplotypes，h)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(the average number of nucleotide difference，k)等。利用 MEGA3.1軟件統(tǒng)計序列的平均堿基組成、多態(tài)位點數(shù)、簡約信息位點數(shù)等。

下載GenBank已公布的14個豬種mtDNACytB基因全序列(見表4)進行比對，利用MEGA5.0軟件應(yīng)用鄰接法(NJ)構(gòu)建了深縣豬、部分地方豬種和引進豬種的CytB基因序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支上的數(shù)字表示用1000次Bootstrap統(tǒng)計分析后對該支的支持百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 深縣豬mtDNA CytB基因目的片段的擴增

從圖1可見，產(chǎn)物條帶清晰，與預期的產(chǎn)物片段大小一致，且特異性良好，可用于后續(xù)測序分析。

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

對mtDNACytB基因片段擴增產(chǎn)物進行測序，獲得40個樣本的擴增序列，去除引物序列和兩端不準確區(qū)域，有效序列全長1 140 bp，見圖2。由圖2可見，所測得序列波峰突出，無雜峰，說明深縣豬mtDNACytB基因全序列得到有效擴增。

2.3 深縣豬mtDNA CytB基因全序列的多態(tài)性

所測40個深縣豬個體長1 140 bp的mtDNACytB基因全序列結(jié)果顯示，A、T、G、C的含量分別為25.93%、31.72%、28.90%及13.45%，其中A+T的含量(57.65%)高于G+C的含量(42.35%)。在1 140 bp長的序列中共發(fā)現(xiàn)2個變異位點，無插入和缺失突變，全部為轉(zhuǎn)換位點，其中簡約信息位點2個，未發(fā)現(xiàn)單一信息位點。

40條序列共定義了3種單倍型，見表1。單倍型多樣性(HD)為0.312，核苷酸多樣性(Pi)為0.00026，平均核苷酸差異數(shù)(K)為0.327。用Tajima's D值(-0.05169)進行中性檢驗，經(jīng)檢驗不顯著(P>0.10)，符合中性突變。

2.4 基于CytB基因全序列的系統(tǒng)進化樹

利用MEGA5.0軟件應(yīng)用鄰接法(NJ)構(gòu)建了深縣豬、部分地方豬種和引進豬種的CytB基因序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3中可以看出，所構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹分為兩大支：第一支主要以地方豬種為主，與大白豬聚為一類；第二支為引進豬種,將杜洛克、漢普夏豬、長白豬聚為一類。其中深縣豬的三種單倍型聚集在同一分支，與萊蕪豬、大蒲臉豬遺傳距離較近。

表1 Cytb基因各單倍型變異位點信息表Table 1 Cytb gene haplotype variation site information table

圖3基于CytB基因全序列構(gòu)建的NJ分子系統(tǒng)樹
Fig.3 NJ Molecular phylogenetic trees of pigs based on the complete sequences ofCytBgene

3 討 論

3.1 CytB基因全序列的變異和多態(tài)性分析

單倍型多樣性(HD)值、核苷酸多樣性(Pi)值和平均核苷酸差異數(shù)(k)是衡量一個品種(群體)mtDNA變異程度的重要指標。單倍型多樣性值和核苷酸多樣性值越小，群體的多態(tài)程度越低，遺傳多樣性越貧乏[6,16]。通過對40條CytB基因全序列分析表明，A+T的含量(57.65%)明顯高于G+C的含量(42.35%)，說明深縣豬mtDNACytB基因全序列富含A+T，能被RNA聚合酶等特異分子識別而作為轉(zhuǎn)錄的起始序列，表現(xiàn)出深縣豬堿基組成的偏倚性，這符合mtDNA的進化特點[7]。本研究結(jié)果顯示，深縣豬群體的單倍型多樣性為0.312，而核苷酸多樣性為0.00026，群體遺傳多樣性呈現(xiàn)出單倍型多樣性高、核苷酸多樣性低的特點。這種“高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性”的現(xiàn)象在其他物種中同樣存在，其主要原因可能是一個較小的有效祖先種群經(jīng)歷了近期的種群數(shù)量擴張[21]。

與國內(nèi)地方豬種進行對比，單倍型多樣性指數(shù)(0.312)低于大河烏豬[11](0.9932)和沂蒙黑豬[4](0.5142)；核苷酸多樣性指數(shù)(0.00026)低于大河烏豬(0.0113)和沂蒙黑豬(0.00045)。以上結(jié)果表明該深縣豬群體母系遺傳多樣性較為貧乏。本實驗室前期對深縣豬D-loop區(qū)遺傳多樣性進行研究，結(jié)果與之相同。

由于該品種是搶救性挖掘、搜集恢復的群體，世代平均近交率取決于有效規(guī)模最小的世代的群體規(guī)模，即產(chǎn)生“瓶頸效應(yīng)”。深縣豬的這種瓶頸效應(yīng)的打擊加上隨后不可避免的近親繁殖造成了遺傳多樣性的貧乏。群體遺傳學證明，若不存在選擇、遷移的影響，近交與遺傳漂變是導致基因丟失的主要原因。一般情況下，小群體基因更容易發(fā)生遺傳漂變，這種波動變化導致某些等位基因的消失，另一些等位基因的固定，從而改變了群體的遺傳結(jié)構(gòu)。而小群體經(jīng)過多代的繁衍，若不做好血統(tǒng)關(guān)系的記錄和在選配、留種中注意家系血統(tǒng)得保持，近交會造成多樣性的降低，加上遺傳漂變作用的影響，遺傳多樣性會降低?，F(xiàn)存的深縣豬群體保種規(guī)模均較小，在保種過程中只注重公豬血統(tǒng)的更新，導致母系遺傳多樣性貧乏，也導致了群體遺傳多樣性的來源較為狹窄。

3.2 基于CytB基因全序列遺傳分析的母系血統(tǒng)

在人類對豬種的干預中，通過不同地區(qū)的豬種間相互雜交，使其發(fā)生基因(核苷酸)交流是一個重要的方面。由于豬在雜交繁育中發(fā)生了基因的交流，其后代在染色體上插入或缺失了某些核苷酸序列和片段，因此產(chǎn)生了新的核苷酸序列或片段，從而在表型上產(chǎn)生各種變異[12]。在深縣豬mtDNACytB基因全序列NJ進化樹中，深縣豬三種單倍型聚為同一分支，母系來源單一，與萊蕪豬、大蒲蓮豬等山東品種遺傳距離較近。中國家豬起源中心存在兩個理論：北方家豬品系起源于北方野豬，南方家豬品系則起源于南方野豬，即南北方起源中心論；中國家豬分別由長江流域和中國南方野豬馴化而來。深縣豬與萊蕪黑豬、大蒲蓮豬同屬于黃淮海黑豬，生長地區(qū)的生態(tài)條件基本相似，農(nóng)作制度、飼料種類、養(yǎng)豬方式類同，隨著生產(chǎn)的發(fā)展，相鄰地區(qū)之間的豬品種不斷發(fā)生血緣交流，各地豬種血統(tǒng)上有相互影響。初步推斷，深縣豬起源可能與山東省的萊蕪黑豬、大蒲蓮豬有關(guān)，而山東省的黑豬則有可能是以湖北及安徽等地的華中型豬種為母本，隨人口向北遷徙經(jīng)長期馴化，選育而形成華北型黑豬，這些以萊蕪豬，大蒲蓮豬為代表的華北型黑豬可能在近代，由山東進入河北，在一定程度上影響了深縣豬的形成。本研究僅從Cytb基因來研究深縣豬群體的遺傳結(jié)構(gòu)還不夠全面，今后應(yīng)綜合利用核內(nèi)核外各種分子標記進行綜合研究，對其起源進行更全面的追溯。

3.3 基于恢復群體遺傳特征的地方豬群體保護

本試驗中的深縣豬群體為企業(yè)集中飼養(yǎng)，群體由少量搜集群體逐漸擴群繁育而成，血統(tǒng)有限，遺傳基礎(chǔ)相對狹窄，加上豬是多胎動物，容易受到血緣的限制[22]?，F(xiàn)今尚存的黃淮海黑豬存在著個體少、育種群體小、血緣稀缺的困境，大部分黃淮海黑豬只有4～6 個血緣, 處于一種瀕危狀態(tài), 也給遺傳多樣性帶來了極大的局限, 對選種不利。針對這種恢復群體遺傳特征由群體血統(tǒng)狹窄造成的群體多樣性較低的現(xiàn)象，建議加大選育和保護力度，進行合理選配和血統(tǒng)分離，創(chuàng)建更多家系，建立種群的遺傳譜系從而避免種群內(nèi)的近親繁殖，增加稀有基因個體的繁殖機會防止稀有基因由于遺傳漂變而在種群中消失，并根據(jù)保種需要和市場需求，適度擴大群體規(guī)模。