李雨衡 林仁露 劉泉

摘要：目的為了使在犯罪現(xiàn)場(chǎng)提取的微量有污染的DNA可以被準(zhǔn)確檢測(cè)出來。方法通過使用全血樣本，在進(jìn)行PCR直擴(kuò)過程中加入DMSO或BSA，并測(cè)序后得出最后結(jié)果，比較兩種試劑的增強(qiáng)效果。結(jié)果兩種方法都不同程度的提高了DNA的擴(kuò)增量，使其檢出率大大提高了。結(jié)論2mg/ml的BSA，0.4mg/ml的DMSO很大程度的提高了DNA的擴(kuò)增量和檢出率。

關(guān)鍵詞：全血樣本;血紅素;PCR;STR;DMSO;BSA

作為目前法醫(yī)物證檢驗(yàn)鑒定的常規(guī)技術(shù)，對(duì)生物檢材中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增是DNA分型中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，而要使DNA分型能夠順利進(jìn)行，就必須提高PCR擴(kuò)增的高效性和靈敏性。在刑事案件現(xiàn)場(chǎng)收集到的DNA檢材通常會(huì)有一定的污染，其會(huì)使檢材無法被準(zhǔn)確檢測(cè)出來，這也是PCR擴(kuò)增失敗的主要原因。

目前，血液中的血紅素已被證實(shí)為PCR抑制物之一[1]，而血液作為刑事案件中常見的生物檢材，在PCR領(lǐng)域中具有較高的研究價(jià)值。當(dāng)前，國內(nèi)外學(xué)者的大量研究以及法醫(yī)學(xué)的大量實(shí)踐可證實(shí)，一定濃度的DMSO或者BSA可提高DNA擴(kuò)增量，但超過一定濃度也會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率的降低，且它們的濃度數(shù)值關(guān)系研究得不夠清楚。盡管市場(chǎng)上已存在很多全血直擴(kuò)試劑盒，但由于對(duì)相關(guān)促進(jìn)PCR擴(kuò)增試劑濃度數(shù)值關(guān)系的不確定，造成其擴(kuò)增效力也不盡相同。通過本次課題研究，對(duì)比出DMSO和BSA對(duì)PCR擴(kuò)增的影響大小，以及各個(gè)合適濃度值來作為PCR增強(qiáng)劑。

1 材料

1.1 檢材提取

采血前讓志愿者洗凈雙手，并用70%乙醇溶液消毒。用采血器采血后用吸血器吸取，然后滴取在已消毒的濾紙上。標(biāo)明姓名和時(shí)間。

1.2 儀器

（1）分析天平。

（2）移液器。

（3）震蕩儀。

（4）打孔器。

（5）純水儀。

（6）高速離心機(jī)。

（7）7500PCR擴(kuò)增儀（由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供）。

（8）3500測(cè)序儀（由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供）。

1.3 試劑

（1）A27plex試劑盒。

（2）BSA（10mg/ml）。

（3）DMSO（1.1mg/ml）。

（4）Taq DNA聚合酶。

（5）甲酰胺。

（6）Ladder。

（7）Liz內(nèi)標(biāo)。

1.4 主要試劑配制

（1）BSA：分別取0.01g、0.02g、0.03g、0.04gBSA于2mlEP管中，加入純水至2ml。使其濃度依次為5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。

（2）DMSO：取濃度為1.1g/ml的DMSO2ml分裝在2mlEP管中。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PCR擴(kuò)增步驟

2.1.1 DMSO實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增前的實(shí)驗(yàn)步驟

（1）在帶有血樣的濾紙上標(biāo)上姓名及采血時(shí)間后待其晾干。

（2）取0.2mlEP管6個(gè)放置于孔板上。

（3）用已消毒的打孔器在有血樣的濾紙片上打孔（每次一下），將所得血樣粒放入0.2mlEP管中，每個(gè)EP管中放置兩粒。

（4）取1個(gè)0.2mlEP管放置在孔板上。

（5）取24μLMix，12μLPrimer，2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中，并置于震蕩器混勻。

（6）將最大量程為10μL的移液器調(diào)至6.4μL，將（2）中混合液取6.4μL，分裝于6個(gè)含有血樣的0.2mlEP管中。

（7）將6個(gè)0.2ml1EP管分別標(biāo)號(hào)為HO（對(duì)照）、HD0.2、HD0.4、HD0.6、陰性和陽性。

（8）然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μLddH2O、3.6μLddH2O、1μL DNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。

（9）將其放置于高速離心機(jī)中以4930rpm速率離心10秒。

2.1.2 BSA實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增前的實(shí)驗(yàn)步驟

（1）在帶有血樣的濾紙上標(biāo)上姓名及采血時(shí)間后待其晾干。

（2）取0.2mlEP管6個(gè)放置于孔板上。

（3）用已消毒的打孔器在有血樣的濾紙片上打孔（每次一下），將所得血樣粒放入0.2mlEP管中，每個(gè)EP管中放置兩粒。

（4）取1個(gè)0.2mlEP管放置在孔板上。

（5）取24μLMix，12μLPrimer，2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中，并置于震蕩器混勻。

（6）將最大量程為10μL的移液器調(diào)至6.4μL，將（2）中混合液取6.4μL，分裝于6個(gè)含有血樣的0.2mlEP管中。

（7）將6個(gè)0.2ml1EP管分別標(biāo)號(hào)為HO（對(duì)照）、HD0.2、HD0.4、HD0.6、陰性和陽性。

（8）然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μL ddH2O、36μLddH2O、1μLDNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。

（9）將其放置于高速離心機(jī)中以4930rpm速率離心10秒。

2.2 PCR擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)

（1）95℃預(yù)變性2min;

（2）94℃10s，60℃1.5min，循環(huán)28次;

（3）60℃延伸20min;

（4）4℃保溫。

2.3 測(cè)序步驟

2.3.1 DMSO實(shí)驗(yàn)的測(cè)序的實(shí)驗(yàn)步驟

（1）取72μL甲酰胺，1.6μL Liz于0.2mlEP管中，并用移液器吹打若干次。

（2）將最大量程為10μL的移液器調(diào)至9.2μL，并將（1）中混合液按照順序以9.2μL分裝至96孔板中。

（3）順次加入1μL Ladder，1μL 陽性對(duì)照，1μL陰性對(duì)照，1μLH0，1μLHD0.2，1μLHD0.4，HD0.6。

（4）將孔板蓋好后放入平板高速離心離心機(jī)中以4930rpm速率離心30秒后取出。

2.3.2 BSA實(shí)驗(yàn)的測(cè)序前的實(shí)驗(yàn)步驟

（1）取81μL甲酰胺，1.8μL Liz于0.2mlEP管中，并用移液器吹打若干次。

（2）將最大量程為10μL的移液器調(diào)至9.2μL，并將（1）中混合液按照順序以9.2μL分裝至96孔板中。

（3）順次加入1μL Ladder，1μL陽性對(duì)照，1μL陰性對(duì)照，1μLH0，1μLHB0.5，1LHB1.0，HB1.5，HB2.0，HB3.0，HB6.0，HB9.0。

（4）將孔板蓋好后放入平板高速離心離心機(jī)中以4930rpm速率離心30秒后取出。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于基因峰值升降趨勢(shì)大致相同，故隨機(jī)抽取三對(duì)堿基：D7S820，D18S51，D8S1179為例進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

3.1 DMSO對(duì)全血PCR擴(kuò)增效率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表（如表1所示）

3.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可得，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為0至4%時(shí)，DMSO對(duì)全血樣本PCR擴(kuò)增效率隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)的升高而升高;當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為4%至6%時(shí)，DMSO對(duì)全血樣本擴(kuò)增效率隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)的升高而降低。其中，根據(jù)統(tǒng)計(jì)圖中峰值可判斷出DMSO對(duì)提升全血樣本擴(kuò)增效率的最適體積分?jǐn)?shù)是在4%，由此得出關(guān)于DMSO的一種增強(qiáng)劑為0.4mg/ml的DMSO。

3.2 BSA對(duì)全血PCR擴(kuò)增效率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表（如表2）

3.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可得，當(dāng)BSA濃度為0至2mg/ml時(shí)，BSA對(duì)全血樣本PCR擴(kuò)增效率隨著BSA濃度升高而升高;當(dāng)BSA濃度為3至9mg/ml時(shí)BSA對(duì)全血樣本PCR擴(kuò)增效率基本進(jìn)入平臺(tái)期。其中，當(dāng)BSA為2mg/ml時(shí)全血樣本PCR擴(kuò)增效率最為明顯，由此得出關(guān)于BSA的增強(qiáng)劑為2mg/ml的BSA。

3.3 組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)表1、2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可得當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為4%、BSA濃度為2mg/ml分別對(duì)應(yīng)提高全血PCR擴(kuò)增效率的最佳濃度。

對(duì)于上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種不同的增強(qiáng)劑對(duì)于不同的基因鏈條擴(kuò)增效果的影響不同，但相對(duì)于空白組H0都較大程度增加了DNA的擴(kuò)增量。從局部來看，單獨(dú)使用BSA（HB2.0）的效果普遍獲得的堿基數(shù)量針對(duì)基因D7S820擴(kuò)增量是最高的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過DMSO（HD0.4），但對(duì)于剩余兩組基因單獨(dú)使用DMSO（HD0.4）要比BSA（HB2.0）擴(kuò)增所得的堿基數(shù)量要高一些，由此無法對(duì)比出兩者對(duì)于PCR反應(yīng)的影響大小。

4 討論

4.1 兩種試劑對(duì)全血PCR效率影響的實(shí)驗(yàn)分析

由于本實(shí)驗(yàn)采用四色熒光測(cè)序，并且根據(jù)最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，DNA峰值升降趨勢(shì)相同，因此以每一組熒光所代表的堿基對(duì)為單位，從每一組熒光測(cè)序組中隨機(jī)選擇一對(duì)堿基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

4.1.1 對(duì)加入DMSO的實(shí)驗(yàn)分析

DMSO是一種無色無味透明液體，有吸水性，分子式為，見圖4。分子含有一個(gè)極性非常高的鍵和兩個(gè)相同的非極性基團(tuán)，因此，它既可溶于非極性溶劑又可溶于極性溶中，因?yàn)檫@種物理化學(xué)特性，可以作為一些不溶于水的化合物的有效溶劑，并且可以破壞水分子之間的氫鍵。工業(yè)上被用于溶劑和萃取劑。在生物學(xué)研究中，它可以作為一個(gè)優(yōu)良的溶劑，而在醫(yī)藥治療中，它可以作為有效的溶媒介物，因此可以用于PCR整個(gè)反應(yīng)體系使之充分混合，同時(shí)DMSO也作為變性劑可直接解除模板DNA的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而增加引物和模板的特異性結(jié)合，降低非特異性結(jié)合，最終獲得滿意的擴(kuò)增效果。

在徐葵，邱志明，汪曉英《DMSO對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響》一文中[3]，受解決δ受體基因?qū)掖问。瑥亩褂皿w積分?jǐn)?shù)為6%至13%DMSO時(shí)，使其順利擴(kuò)增的啟發(fā)。將預(yù)實(shí)驗(yàn)中DMSO的體積分?jǐn)?shù)分別定為6%，8%和10%。但實(shí)際操作中，用體積分?jǐn)?shù)為6%，8%和10%的DMSO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)超過6%時(shí)，會(huì)對(duì)全血樣本PCR的擴(kuò)增效率起到抑制作用。因此，以6%的體積分?jǐn)?shù)為界限，研究體積分?jǐn)?shù)為2%，4%，6%時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

通過對(duì)表1和圖1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可得，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為2%至4%時(shí)，全血PCR擴(kuò)增效率逐漸升高，在其體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)達(dá)到峰值;其體積分?jǐn)?shù)超過4%后，全血PCR擴(kuò)增效率逐漸降低。可分析出，對(duì)A21plex試劑盒而言，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)小于4%時(shí)，可直接接觸全血DNA模板的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)引物和全血DNA模板的特異性結(jié)合;當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)大于4%時(shí)，DMSO會(huì)對(duì)Taq DNA聚合酶產(chǎn)生抑制作用。而Taq DNA聚合酶作為PCR擴(kuò)增所需材料，一旦其失去活性，會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率的下降。