朱華玲，班立桐，黃 亮，王 玉，楊紅澎，孫 寧

（1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus)又名玉蕈、斑玉蕈、海鮮菇等，屬擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 白蘑科（Tricholomataceae） 離褶菌科（Lyphyllaceae） 玉蕈屬（Hypsizygus），是一種優(yōu)良的食用菌，其味比平菇鮮，肉比滑菇厚，質(zhì)比香菇韌，口感極佳，是不可多得的食藥兼用的可工廠化生產(chǎn)的珍稀食用菌之一[1-5]，其產(chǎn)量?jī)H次于金針菇與杏鮑菇，是食用菌市場(chǎng)的主力軍[6]。菌種是真姬菇生產(chǎn)中至關(guān)重要的生產(chǎn)資料，妥善保藏菌種的意義重大。選擇一種合適的保藏真姬菇菌種的介質(zhì)，可提高菌種的品質(zhì)和效益[7-12]。通過(guò)對(duì)比22種不同介質(zhì)對(duì)真姬菇菌種的保藏效果，以期為真姬菇菌種的簡(jiǎn)單有效保藏提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

真姬菇菌種HB-1斜面母種，由天津農(nóng)學(xué)院食用菌研發(fā)中心提供；馬鈴薯淀粉與葡萄糖混合物（質(zhì)量比 1∶4）；溴百里酚藍(lán)（bromothymol blue，BTB）；3-（4，5-二甲基-2-噻唑） -2，5-二苯基溴化四唑〔3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT〕，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）；瓊脂；磷酸二氫鉀；硫酸鎂；石膏；葡萄糖；NaCl；聚乙二醇；礦泉水；純凈水；超純水；蒸餾水；櫟木；楊木；腐木；麩皮?；瘜W(xué)藥品均為分析純。

恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海精密儀器儀表公司；超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海析譜儀器有限公司；水分測(cè)定儀，江蘇維科特儀器儀表有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水溶液保藏

將蒸餾水、礦泉水、超純水、純凈水等在1×105Pa下高壓滅菌20 min。用滅菌后的蒸餾水配置不同濃度NaCl、葡萄糖和聚乙二醇溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，濾液作為保藏水溶液，備用。用接種針將5個(gè)直徑為9 mm的真姬菇菌塊轉(zhuǎn)入已滅菌的5 mL凍存管中，移入3 mL～4 mL保藏水溶液，浸沒(méi)菌塊，密封，置于4℃冰箱中保藏，設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.2.2 木屑保藏

按照參考文獻(xiàn)[13]將木屑過(guò)篩，僅保留1目～2目大小的木屑，用純水或浸泡鹽水（磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0.05%，pH 7.0） 進(jìn)行浸泡預(yù)處理，處理好后裝瓶。裝瓶方法為將洗凈烘干在121℃下滅菌1 h后的錐形瓶冷卻后，先后裝入下層（純木屑）和上層（質(zhì)量比為木屑∶麩皮∶石膏=39∶10∶1） 的保藏木屑，上下兩層木屑的質(zhì)量比為1∶3，裝入下層木屑時(shí)需邊裝邊搖，使木屑盡量緊實(shí)；裝上層培養(yǎng)基時(shí)適度搖動(dòng)，保證上下兩層分層明顯。錐形瓶裝好木屑后，密封，1×105Pa下高壓蒸汽滅菌2.5 h。待木屑溫度降至30°C以下時(shí)，在表面接入直徑為9 mm的真姬菇菌塊2塊，25°C下恒溫培養(yǎng)20 d。待木屑表面長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲后，置于4°C冰箱中保藏，設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.2.3 斜面（對(duì)照） 保藏

制作普通PDA培養(yǎng)基，滅菌，擺斜面。接入一個(gè)直徑9 cm的真姬菇菌塊，25°C培養(yǎng)15 d后，置于4°C冰箱內(nèi)進(jìn)行保藏，設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.3 保藏效果測(cè)定

1.3.1 菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定

菌種分別保藏6個(gè)月和9個(gè)月后，在25°C下復(fù)蘇培養(yǎng)3 d。取一個(gè)直徑9 mm菌塊，轉(zhuǎn)接到PDA平板上，菌絲萌發(fā)后測(cè)量菌落直徑，25°C下培養(yǎng)48 h后測(cè)量菌落直徑，菌絲生長(zhǎng)速率（v，cm·d-1）計(jì)算公式為：

式中：d1為菌絲萌發(fā)后菌落直徑（cm）；d2為25°C下培養(yǎng)48 h后菌落直徑（cm）。

1.3.2 菌絲脫氫酶活力測(cè)定

稱(chēng)取從 1.3.1 中 PDA 平板上刮取的菌絲體 0.1 g，裝入15 mL離心管中，加入蒸餾水2 mL，5 mg·mL-1的MTT水溶液0.2 mL，35°C水浴避光靜置3 h。用注射器抽走液體，僅留菌絲，加入DMSO 2 mL，繼續(xù)35°C水浴避光靜置4 h。取上清液100 μL，以DMSO作空白，在490 nm波長(zhǎng)處，測(cè)吸光度[14]。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)的差異性分析

采用軟件SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），使用Duncan檢驗(yàn)方法，顯著水平設(shè)為P＜0.05[15]，考察不同保藏方法的菌絲生長(zhǎng)速率、脫氫酶活性之間的相關(guān)性和差異性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長(zhǎng)速率

采用不同介質(zhì)對(duì)真姬菇菌種分別保藏6個(gè)月和9個(gè)月后，測(cè)定保藏菌種的菌絲生長(zhǎng)速率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同介質(zhì)保藏菌種的平均菌絲生長(zhǎng)速率Tab.1 Average mycelium growth rate of the strains preserved in different media

從表1可以看出，真姬菇菌種在不同介質(zhì)中保藏6個(gè)月和9個(gè)月時(shí)后的菌絲的生長(zhǎng)速率是各不相同的。保藏6個(gè)月時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率最快的介質(zhì)是0.6%葡萄糖溶液，其次是0.1%PEG6000，第三是0.9%NaCl溶液。除了PDA斜面保藏的菌種，其菌絲生長(zhǎng)速率較低，僅為0.25 cm·d-1以外，其余保藏介質(zhì)所保藏菌種的菌絲生長(zhǎng)速率均較高，大于等于0.625 0 cm·d-1。對(duì)比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各種水以及木屑等保藏介質(zhì)對(duì)真姬菇菌種進(jìn)行6個(gè)月保藏后的菌絲生長(zhǎng)速率發(fā)現(xiàn)，葡萄糖溶液的保藏效果最好，其次為PEG溶液，后面依次是各種水、氯化鈉溶液、保藏木屑和PDA斜面。保藏9個(gè)月時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率最快的介質(zhì)是礦泉水，其次是0.1%PEG10000，第三的是0.1%PEG和超純水，與PDA斜面相對(duì)比，0.9%NaCl、1.2%NaCl、1.0%葡萄糖溶液和4種木屑介質(zhì)所保藏的菌種，其菌絲生長(zhǎng)速率較低，均低于0.35 cm·d-1，其余保藏介質(zhì)所保藏菌種的菌絲生長(zhǎng)速率均較高。同樣對(duì)比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各種水和木屑等保藏介質(zhì)對(duì)真姬菇菌種進(jìn)行9個(gè)月保藏的菌絲生長(zhǎng)速率發(fā)現(xiàn)，PEG溶液與各種水的保藏效果相當(dāng)，是各介質(zhì)中最好的，后面依次是葡萄糖溶液、氯化鈉溶液、PDA斜面和保藏木屑。

整體對(duì)比來(lái)看，菌種保藏6個(gè)月時(shí)的菌絲生長(zhǎng)速率明顯高于保藏9個(gè)月的情況。綜合對(duì)比2個(gè)時(shí)段的菌絲生長(zhǎng)速度來(lái)看，保藏效果比較好的3種介質(zhì)依次是0.1%PEG10000、0.6%葡萄糖溶液和礦泉水，而保藏效果比較差的3種介質(zhì)分別是PDA斜面、楊木+水和楊木+鹽水。

2.2 菌絲脫氫酶活力

采用不同介質(zhì)對(duì)菌種分別保藏6個(gè)月和9個(gè)月后，測(cè)定保藏菌種的菌絲脫氫酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，真姬菇菌種在不同介質(zhì)中保藏6個(gè)月和9個(gè)月時(shí)后的菌絲脫氫酶活力是各不相同的。保藏6個(gè)月時(shí)的菌絲脫氫酶活力明顯好于菌種保藏9個(gè)月的情況。保藏6個(gè)月時(shí)，菌絲脫氫酶活力最高的介質(zhì)是0.1%PEG6000，其次是純凈水和礦泉水，再次是0.1%PEG20000，除楊木+水介質(zhì)外，其余介質(zhì)所保藏菌種的菌絲脫氫酶活力均高于PDA斜面。從介質(zhì)組成來(lái)看，各種水、PEG溶液、NaCl溶液和葡萄糖溶液所保藏菌種的菌絲脫氫酶活力依次降低，但均明顯好于保藏木屑和PDA斜面。保藏9個(gè)月時(shí)，菌絲脫氫酶活力最高的介質(zhì)是0.1%PEG6000和0.8%葡萄糖溶液，其次是1.0%葡萄糖溶液和0.1%PEG10000，再次是純凈水。與PDA斜面相對(duì)比，0.3%NaCl溶液所保藏菌種的菌絲脫氫酶活力略低，其余保藏介質(zhì)所保藏菌種的菌絲脫氫酶活力均高于PDA斜面。對(duì)比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各種水和保藏木屑等介質(zhì)對(duì)真姬菇菌種進(jìn)行9個(gè)月保藏后的菌絲脫氫酶活力發(fā)現(xiàn)，葡萄糖溶液的保藏效果最好，各種水的保藏效果略差，PEG溶液與保藏木屑的保藏效果相當(dāng)，居第三，再后面依次是PDA斜面和氯化鈉溶液。

表2 不同介質(zhì)保藏菌種的菌絲脫氫酶活力Tab.2 Average mycelium dehydrogenase activity of the strains preserved in different media

綜合對(duì)比2個(gè)時(shí)段的菌絲脫氫酶活力來(lái)看，保藏效果比較好的3種介質(zhì)依次是0.1%PEG6000、1.0%葡萄糖溶液和純凈水。保藏效果比較差的3種介質(zhì)依次是PDA斜面、櫟木+水和楊木+水。

2.3 保藏效果的綜合分析

為方便觀察分析，將22種保藏介質(zhì)對(duì)真姬菇菌種進(jìn)行保藏6個(gè)月和9個(gè)月的菌絲生長(zhǎng)速度和菌絲脫氫酶活力進(jìn)行了匯總和對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，綜合考慮22種介質(zhì)對(duì)真姬菇菌種保藏6個(gè)月和9個(gè)月的總體效果，不難看出，0.1%PEG6000溶液的總體保藏效果最好，其次是0.1%PEG10000溶液和超純水，再次是0.8%葡萄糖溶液和礦泉水。其他介質(zhì)中也有保藏效果較好的，但僅在某個(gè)時(shí)段較好，例如0.6%葡萄糖溶液在保藏9個(gè)月時(shí)菌種擁有較好的菌絲生長(zhǎng)速度和脫氫酶活力，但保藏6個(gè)月時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度較高，脫氫酶活力卻較低。再如用純凈水保藏6個(gè)月時(shí)真姬菇菌種擁有較好的菌絲生長(zhǎng)速度和脫氫酶活力，但保藏9個(gè)月時(shí)菌絲脫氫酶活力較高，菌絲生長(zhǎng)速度卻較低。

2.4 保藏效果評(píng)價(jià)指標(biāo)參數(shù)的差異性分析

為評(píng)價(jià)采用的2種指標(biāo)參數(shù)（菌絲生長(zhǎng)速度與脫氫酶活力）在評(píng)價(jià)保藏效果的優(yōu)劣性，進(jìn)一步采用Duncan檢驗(yàn)方法對(duì)表1、表2中6個(gè)月和9個(gè)月試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行了單因素方差分析，分別考察脫氫酶活力對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的差異性水平，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 差異性分析數(shù)據(jù)表Tab.3 The data of difference analysis

如表3所示，顯示保藏6個(gè)月時(shí)脫氫酶活力對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的顯著性結(jié)果分別為0.077；保藏9個(gè)月時(shí)脫氫酶活力對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的顯著性結(jié)果分別為0.624；所有結(jié)果的保藏效果均大于0.05，表明無(wú)顯著差異。

3 結(jié)論與討論

采用22種不同保藏介質(zhì)對(duì)真姬菇菌種進(jìn)行6個(gè)月和9個(gè)月保藏試驗(yàn)。結(jié)果表明，0.1%PEG6000溶液的總體保藏效果最好，其次是0.1%PEG10000溶液與超純水，再次是0.8%葡萄糖溶液和礦泉水。0.6%葡萄糖溶液僅適于真姬菇菌種9個(gè)月保藏，純凈水僅適于真姬菇菌種6個(gè)月保藏。其他介質(zhì)的保藏效果略差。不同保藏介質(zhì)能夠提供的環(huán)境和條件不同，也決定了不同保藏效果。本試驗(yàn)中選用22種保藏介質(zhì)中，有的含有少量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有的則僅提供水分，但各介質(zhì)保藏效果卻沒(méi)有表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量越多，效果越好的特點(diǎn)，這可能與不同狀態(tài)菌絲對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求也不同有關(guān)。