陳云蘭 李學玲 蔣快樂 莫麗珍 周志偉 陳治華 桂花

摘? 要：以云南阿拉比卡咖啡為原料，在咖啡濕法發(fā)酵環(huán)節(jié)中加入Pectinex Ultra SP-L果膠酶進行脫膠，并對加工出的咖啡豆進行理化及感官分析。結果表明：與自然發(fā)酵脫膠相比，果膠酶脫膠能縮短脫膠時間，有效快速脫除咖啡果膠。其脫膠時間與果膠酶的濃度、脫膠溫度、鮮果成熟度呈正相關。與自然發(fā)酵脫膠相比，果膠酶脫膠所得咖啡豆的內含物質無顯著差異，杯品質量干凈穩(wěn)定。就咖啡豆的杯品質量而言，0.01%果膠酶添加量脫膠處理要高于自然發(fā)酵脫膠，而添加量為1.00%、0.10%果膠酶脫膠處理略低于自然發(fā)酵脫膠。綜上所述，果膠酶脫膠能保證咖啡品質的穩(wěn)定性及提高咖啡加工效率，具有應用前景。

關鍵詞：咖啡;濕法發(fā)酵;果膠酶;脫膠時間;杯品質量

中圖分類號：TS273? ???文獻標識碼：A

Abstract： Yunnan arabica coffee was used as the raw material. Pectinex Ultra SP-L pectinase was added in the wet fermentation process of coffee to remover pectin， and the physicochemical and sensory properties of the processed coffee beans were analyzed. The results show that pectinase could effectively and rapidly remove coffee pectin compared with the natural fermentation， and the pectin removing time was positively correlated with the concentration of pectinase， pectin removing temperature and maturity of fresh fruits. There was no significant difference in the contents of coffee beans obtained with pectinase and natural fermentation， and the cup quality was clean and stable. The cup quality of coffee beans treated by pectinase with low concentration of 0.01% was higher than that by natural fermentation， while that of the 1.00% and 0.10% pectinase treated was slightly lower than that of the natural fermentation.

Keywords： coffee; wet fermentation; pectinase; pectin removing?time; cup quality

咖啡鮮果外果皮和內果皮之間有一層果膠狀物，組成成分復雜，主要由水分、多種糖類、果膠等組成，其物質在咖啡濕法發(fā)酵過程中會被降解脫除[1]。發(fā)酵降解果膠方式與香氣特征呈現存在復雜關系[2-3]，可通過不同的發(fā)酵方法來調整咖啡香氣[4-5]。脫膠是濕法加工過程中的關鍵環(huán)節(jié)，在咖啡脫皮后，以水為介質，把脫皮后的咖啡浸泡到水中，依靠果膠本身所含的酶進行生物發(fā)酵脫膠，復雜且質量難把控[6]，發(fā)酵過程控制不當會給咖啡的香氣及風味帶來負面影響，發(fā)酵不足及過度發(fā)酵是生產中比較突出的問題。

目前咖啡脫膠主要有自然發(fā)酵、機械、化學和物理脫膠[7]。自然發(fā)酵脫膠時間長且易受環(huán)境溫度影響，而機械脫膠破損率高，化學脫膠污染大，物理脫膠不干凈，以上脫膠技術均在不同程度上制約著咖啡品質和經濟效益的提高。生產上需要一種優(yōu)質穩(wěn)定而高效的脫膠方法。生物脫膠是一種綠色環(huán)保的方法，主要包括微生物脫膠和酶脫膠，在食品加工、亞麻加工等方面應用較多[8-10]。國外將生物脫膠應用于咖啡發(fā)酵脫膠的研究相對國內比較成熟[11]。Silva等[12]、de Melo等[13]、Avallone等[14]篩選具有果膠溶解活性的細菌和酵母種類，確定其是否適合作為生物發(fā)酵劑在咖啡中使用。Evangelista等[15-16]采用精選的酵母菌進行生物發(fā)酵，提高咖啡飲品質量。以上均是關于微生物在咖啡脫膠方面的研究，但采用生物酶在咖啡脫膠方面的研究比較少。本研究擬開展果膠酶脫膠對脫膠速度及咖啡品質影響的研究，在咖啡濕法發(fā)酵過程中加入不同濃度的Pectinex Ultra SP-L果膠酶進行發(fā)酵脫膠，測定感官及理化指標，篩選出最佳的經濟濃度，獲得基礎數據，為云南阿拉比卡咖啡濕法加工妥善解決發(fā)酵品質穩(wěn)定性提供一定的理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 咖啡鮮果采摘于云南農業(yè)大學熱帶作物學院咖啡種植園，海拔1000～1200 m，品種為目前云南主栽的阿拉比卡咖啡。

果膠酶為諾維信公司生產的Pectinex Ultra SP-L 咖啡果膠酶。

1.1.2? 儀器與設備? 6KTP-480型咖啡脫皮機，UV-1800PCDS2型分光光度計，上海榮欣DHG-9145A型干燥箱，梅特勒-托利多ME204E型電子分析天平。

1.2? 方法

1.2.1? 果膠酶濃度與脫膠時間? 取40 kg全成熟的咖啡鮮果，進行浮選分級，剔除漂浮果及異物，用咖啡脫皮機進行脫皮，將帶果膠的咖啡平均分成4份，每份6 kg，分別放進裝有4 L清水、無蓋的不銹鋼桶里，再分別加入豆和清水總重量的0.01%、0.10%、1.00%濃度 Pectinex Ultra SP-L果膠酶，以不加果膠酶為對照。每隔 20 min觀察1次脫膠程度，脫膠程度的判斷方法采用物理方法，用手抓取咖啡豆并搓揉，當豆體不黏滑有粗糙感時界定為完成脫膠。脫膠過程中的最低溫度為17?℃，最高溫度為30?℃。

1.2.2? 溫度對果膠酶脫膠時間的影響? 取30 kg全成熟的咖啡鮮果，進行浮選分級，剔除漂浮果及異物，用咖啡脫皮機進行脫皮，將帶果膠的咖啡豆平均分成3份，每份6 kg，分別放進裝有4 L清水、無蓋的不銹鋼桶里，選用 Pectinex Ultra SP-L 果膠酶的濃度為0.01%，分3次實驗，分別是2017年11月、2017年12月、2018年1月分別于晚上和白天自然日照下研究溫度對果膠酶脫膠時間的影響。晚上定義為19：00—6：59;白天定義為7：00—18：59，所計溫度為室外咖啡豆體溫度，為能與生產實際結合，采用自然溫度，不采用人工控溫。

1.2.3? 鮮果成熟度對果膠酶脫膠時間的影響? 在初步確定最佳經濟濃度為0.01%后，分別采用過熟果、全紅果、青果、及3者未分選混果4個不同等級的樣品研究鮮果成熟度對果膠酶脫膠時間的影響。

1.2.4? 咖啡豆理化指標檢測方法? 水分采用LY-TK2咖啡豆水分測試儀檢測;灰分按 GB/T 5009.4-2010標準檢測;咖啡因按GB/T 5009.139- 2003 標準檢測;總糖按GB/T 5009.7-2008標準檢測;粗蛋白按 GB/T 5009.5-2010 標準檢測;粗脂肪按GB/T 5009.6-2003標準檢測;鎂含量按GB 5009.241-2017標準檢測;鈣含量按GB 5009.92- 2016 標準檢測;鐵含量按GB 5009.90-2016標準檢測。

1.2.5? 咖啡熟豆杯品質量評價? （1）咖啡杯品質量檢測。本研究參照美國精品咖啡協會（SCAA）咖啡杯測評定方法進行。評定指標包括：干香/濕香（fragrance/aroma）、風味（flavor）、回味（aftertaste）、酸度（acidity）、醇厚度（body）、平衡感（balance）、一致性（uniformity）、干凈度（clean cup）、甜味（sweetness）、整體評價（overall）等10個方面。從6分開始標注打分，一共分為4個級別，6分為“好”（good）;7分為“非常好”（very good）;8分為“優(yōu)秀”（excellent）;9分為“超凡”（outstanding）。每個等級又分4個給分等級，給分單位是0.25分，因此，4個等級共16個給分點。邀請經過專業(yè)訓練的6名咖啡品鑒師（Q grader）進行評價。

（2）?咖啡烘焙方法。杯品熟豆采用SCAA生豆標準化烘焙進行烘焙，樣品烘焙全豆的Agtron值為58（+/1），研磨咖啡粉的Agtron值為63（+/1），樣品烘焙12小時后進行杯測。所有樣品都采用相同的烘焙曲線，烘焙曲線記錄見表1。

1.3? 數據處理

采用 Excel 2010 軟件處理數據，利用SPSS 16.0 軟件計算平均值及進行差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? 果膠酶制劑的最佳經濟濃度選擇

使用不同濃度的果膠酶后咖啡果脫膠時間見表2。由表2可見，自然發(fā)酵脫膠果膠全部脫除需要46 h，近2 d的時間。添加果膠酶酶解以后，脫膠時間隨著所添加果膠酶的濃度增加而縮短，其說明脫膠效率與添加果膠酶濃度呈正相關。為保證咖啡的品質，咖啡鮮果采摘以后都需放置在陰涼通風的地方，并于采摘當天進行加工處理，在生產上一般都是早上8：00左右采摘，晚上19：00加工。若采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵脫膠，因發(fā)酵時間太長，往往需要將鮮果囤放幾天來解決發(fā)酵池的使用問題，也易導致發(fā)酵過度而影響品質。采用果膠酶脫膠可縮短發(fā)酵脫膠時間，從而加速脫膠速度，解決自然脫膠耗時、品質不穩(wěn)定的問題。

2.2? 溫度對果膠酶脫膠時間的影響

篩選出最佳的經濟濃度0.01%后，為能在生產中更好的推廣使用，選用日間和夜間發(fā)酵脫膠溫度來對比發(fā)酵溫度對脫膠時間的影響。由表3可知，加入相同濃度的果膠酶脫膠后，日間脫膠時間比夜間脫膠時間短。3個月份的日間溫度在21～27?℃之間，夜間溫度在11～13?℃之間。因此，在11～27?℃溫度范圍內，咖啡的脫膠時間與溫度呈正相關。溫度對于果膠酶的活性影響較大，溫度過高容易使酶變性，溫度過低，酶促反應速率較低。果膠酶多以單體形式存在，最適溫度為45～50?℃，60?℃保溫條件時，酶活性下降速度快[17]。咖啡產區(qū)主要分布在熱帶、亞熱帶南北緯25靠近赤道以內的區(qū)域。在產區(qū)生產加工過程中，脫膠發(fā)酵池均建在室外，基本無法做到人工調控發(fā)酵脫膠溫度。本研究是基于咖啡生產過程中的室外發(fā)酵脫膠環(huán)境，及普洱當地的氣溫范圍來研究溫度對果膠酶脫膠時間的影響。

2.3? 鮮果成熟度對果膠脫膠時間的影響

將采摘回來以后的鮮果按照成熟度分為過熟果、全紅果、青果及3者未分選的混果4個等級，加入等量0.01%的果膠酶。由表4可知，在過熟果、全紅果和青果3個等級中，成熟度越高，添加果膠酶后的脫膠時間越短。這與咖啡鮮果在成熟過程中自身所帶微生物產生果膠酶有關。在果實成熟之前，果膠主要是以不溶于水的原膠形式存在，隨著果實的成熟，果實中的一些酶類能夠通過斷裂果膠的主鏈或是側鏈來改變果膠的結構，原果膠結構改變后，它們將細胞間的果膠質溶解，從而使果實變得松軟[18]，形成能夠溶于水的果膠類物質。Muhammad[19]研究表明，咖啡果皮含有果膠酯酶和多甲酯酶，綠色果實上的酶活性高于黃色果實。果實變淺紅色時，活性第2次增加，果實的最佳發(fā)酵條件取決于果實的成熟程度，當果實顏色變暗紅色時果膠酶的活性最佳。董紅紅[20]研究發(fā)現，咖啡濕法發(fā)酵過程中的微生物里有產生果膠酶的菌種。因此，成熟度越高的咖啡果實，加入相同濃度的果膠酶后脫膠時間越短。

2.4? 生咖啡豆水分的測定

在咖啡濕法發(fā)酵脫膠環(huán)節(jié)添加不同濃度的果膠酶脫膠后，通過采用相同的自然干燥條件，將所得咖啡生豆的含水率控制在一定范圍內，提高烘焙階段咖啡豆的風味口感[21]，同時可避免在咖啡杯品時因水分含量差異所帶來的感官風味誤差。通過檢測（表5），4個處理咖啡生豆的含水率在11.2%～11.5%之間，符合咖啡生豆儲存含水率在11.5%～12.5%之間的標準[22]，且它們之間的

2.5? 咖啡熟豆主要理化成分分析

由表6可以看出，脫膠環(huán)節(jié)加入0.01%、0.10%、1.00%的果膠后，咖啡熟豆里的灰分、脂肪、蛋白質、總糖、咖啡因、綠原酸等內含物質與傳統(tǒng)自然發(fā)酵相比，差異不顯著。說明在咖啡初加工過程中添加果膠酶不會影響或改變咖啡豆的主要化學成分，能保證品質的穩(wěn)定性。

2.6? 添加果膠酶脫膠后咖啡熟豆的杯品質量分析

咖啡杯品是檢驗咖啡質量、口味的一種方法，杯品結果是咖啡品質的重要指標，在咖啡貿易中，咖啡杯測是一個必經的檢測環(huán)節(jié)?？Х榷菇涍^統(tǒng)一標準烘焙，采用美國精品咖啡協會（SCAA）杯測表對樣品感官質量評估打分，每個樣品測5杯。

由表7可以看出，添加1.00%濃度的果膠酶脫膠所得咖啡豆的杯品質量最差，添加0.01%果膠酶脫膠所得咖啡豆的杯品質量最好。自然發(fā)酵脫膠所得咖啡豆的杯品質量略高于果膠酶濃度為0.10%的處理，這可能是與脫膠過程中的發(fā)酵時間長短產生特征香氣有關。添加高濃度的果膠酶后，縮短了脫膠時間，減少了發(fā)酵時間，有些風味物質還沒被激活，導致風味品質不是最好。而自然發(fā)酵脫膠時間太長，導致有些成分流失，Velmo?u?rougane[5]研究表明，在阿拉比卡咖啡中經過20?h發(fā)酵獲得良好的杯品特性，隨著更長時間的發(fā)酵風味成分略有減少，主要原因是發(fā)酵液中真菌數量增加。本研究加入高濃度果膠酶雖然可大大縮短脫膠時間，提高加工效率，但杯品質量并不是最好的，所以要篩選出能提高加工效率又能最大程度激發(fā)出咖啡風味物質的果膠酶添加濃度，即為0.01%。

從SCAA評價標準來看，4個處理分數集中在80分上下，得分最高的是果膠酶濃度為0.01%的一組，81.33。得分最低的是果膠酶添加濃度1.00%的處理組，為79.54兩者差距1.88分，但均在精品咖啡范圍內。因此，在咖啡濕法加工中使用果膠酶，咖啡杯品質量是比較穩(wěn)定的。

2.7? 添加果膠酶脫膠后經濟效益評估

由表8可知，傳統(tǒng)自然發(fā)酵脫膠時間為46 h，期間需要更換2次發(fā)酵脫膠用水，且需要人工攪拌數次，添加0.01%果膠酶后，發(fā)酵時間僅需13?h，縮短了33 h，每噸鮮果可直接節(jié)約180元的成本。同時，解決了采收旺季因自然發(fā)酵脫膠時間長發(fā)酵池及人工緊張問題。此外，加工用水節(jié)約的同時減少了脫膠廢水的排放量，降低環(huán)境污染。綜合評估，使用果膠酶脫膠可以節(jié)約生產成本。

3? 討論

咖啡是云南的特色產業(yè)之一，咖啡脫膠技術是初加工過程中影響品質的重要環(huán)節(jié)之一，云南咖啡80%以上都采取濕法加工的方式來生產水洗咖啡。廣大的咖啡種植農戶和小企業(yè)采用發(fā)酵脫膠的傳統(tǒng)濕法加工方式[23]，其方式存在發(fā)酵時間長、耗水量大、占用發(fā)酵池、發(fā)酵程度把握不準容易出現過度發(fā)酵問題。本研究以云南阿拉比卡咖啡為原料，在咖啡濕法加工發(fā)酵脫膠過程中使用Pectinex Ultra SP-L型果膠酶進行脫膠。研究發(fā)現，Pectinex Ultra SP-L型果膠酶能縮短咖啡果膠脫膠時間，從而加快脫膠速度，脫膠時間與所添加果膠酶的濃度成正比，這與程金煥等[24]的研究結論一致。本研究進一步發(fā)現，脫膠時間還與脫膠溫度、鮮果成熟度呈正比。常規(guī)理化分析表明，果膠酶脫膠不會影響咖啡豆內含物質灰分、總糖、脂肪、蛋白質、咖啡因、綠原酸的含量。添加0.01%濃度的Pectinex Ultra SP-L果膠酶后咖啡熟豆的杯品質量最好，這與恰當的發(fā)酵脫膠時長有關系，發(fā)酵不足或發(fā)酵過度都會影響咖啡的品質。使用1.00%、0.10%、0.01%的果膠酶脫膠后，所得咖啡豆杯品質量與傳統(tǒng)發(fā)酵脫膠所得咖啡豆的杯品質量總體趨于一致，其說明果膠酶的合理使用不會對咖啡豆的品質帶來負面影響，能保證品質的一致性。同時，縮短脫膠時間以后，脫膠用水及人工減少，脫膠發(fā)酵池利用頻率提高，節(jié)約成本，還可減少脫膠廢水排放，有利于保護環(huán)境污染。

本研究僅僅從普洱咖啡產區(qū)氣候情況為實驗條件進行研究，因酶的專一性及活性受限比較大，若需要在其它咖啡產區(qū)推廣使用，最佳濃度還需根據當地氣候條件進行篩選。咖啡的風味除了與內含物質脂肪、蛋白質、總糖、咖啡因、綠原酸及礦物質有關外，還與香氣成分密切關聯，本研究未對使用果膠酶后的咖啡香氣成分及形成機理做研究，這也是下一步研究的方向及重點。

參考文獻

Bhumiratana N， Adhikari K， Chmbers E， et al. Evolution of sensory aroma attributes from coffee beans to brewed coffee[J]. LWT - Food Science and Technology， 2011， 44（10）： 2185-2192.

Mussatto S I， Machado E M， Martins S， et al. Production composition and application of coffee and its industrial residues[J]. Food and Bioprocess Technology， 2011， 4（5）： 661-672.

Liang W L， Mum W C， Philip C， et al. Coffee fermentation and flavor An intricate and delicate relationship[J]. Food Chemistry， 2015， 185： 182-191.

Poisson L， Schmalzrie D， Davidek T， et al. Study on the role of precursors in coffee flavor formation using in-bean experiments[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009， 57（21）： 9923-9931.

Velmourougane K. Impact of natural fermentation on physicochemical， microbiological and cup quality characteristics of arabica and robusta coffee[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， India Section B： Biological Sciences， 2013， 83（2）： 233-239.

武瑞瑞， 李貴平， 王雪松， 等. 咖啡濕法加工過程中影響品質的因素分析[J]. 熱帶農業(yè)工程， 2012， 36（5）： 1-3.

黃家雄， 呂玉蘭， 周志偉， 等. 咖啡酶促脫膠技術試驗初報[J]. 中國熱帶農業(yè)， 2016（5）： 62-65.

羅? 勤， 張? 金， 秋? 亞， 等. 麻纖維生物脫膠初探[J]. 染整技術， 2018， 40（5）： 33-35.

汪? 澤， 魏曉奕， 崔麗虹， 等. 菠蘿葉纖維脫膠工藝研究進展[J]. 廣東化工， 2016， 43（21）： 102-103.

孫? 穎， 李? 杰， 王曰轉， 等. 烏拉草生物脫膠工藝研究[J]. 毛紡科技， 2015， 43（6）： 53-55.

李曉嬌， 楊鸞芳. 小?？Х让撃z技術研究進展[J]. 中國農業(yè)信息， 2014（11）： 104.

Silva C F， Vilela D M， de Souza Cordeiro C， et al. Evaluation of a potential starter culture for enhance quality of coffee fermentation[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2013， 29（2）： 235-247.

de Melo Pereira G V， Soccol V T， Pandy A， et al. Isolation， selection and evaluation of yeasts for use in fermentation of coffee beans by the wet process[J]. International Journal of Food Microbiology， 2014， 188： 60-66.

Avallone S， Guyot B， Brillouet J M， et al. Microbiological and biochemical study of coffee fermentation[J]. Current Microbiology， 2001， 42（4）： 252-256.

Evangelista S R， da Cruz Pedrozo Miguel MG， de Souza Cordeiro C， et al. Inoculation of starter cultures in a semi-dry coffee （Coffea arabica） fermentation processe[J]. Food Microbiology， 2014， 44： 87-95.

Evangelista S R， Silva C F， Miguel M G P D C， et al. Improvement of coffee beverage quality by using selected yeasts strains during the fermentation in dry process[J]. Food Research International， 2014， 61： 183-195.

薛茂云， 楊愛萍， 鄭? 萍， 等. 果膠酶酶學特性研究[J]. 中國調味品， 2016， 41（3）： 74-76.

劉長高. 產果膠酶細菌的篩選發(fā)酵優(yōu)化及在香蕉假莖生物脫膠上的應用[D]. 海口： 海南大學， 2015.

Muhammad S D. Determination of harvesting time and fermentation conditions of coffee （Coffee sp.） beans based on the fruit pericarp enzyme activity[J]. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan， 2001： 1-10.

董紅紅. 云南小粒咖啡濕法發(fā)酵中微生物的研究[D]. 北京： 北京化工大學， 2013.

于啟洋. 小?？Х冉槎固匦匝芯縖D]. 昆明： 昆明理工大學， 2017.

李學俊， 莫麗珍. 咖啡檢驗與杯品[M]. 昆明： 云南大學出版社， 2013.

肖? 兵， 匡? 鈺， 李維銳. 云南小粒種咖啡初加工工藝技術改進與創(chuàng)新[J]. 中國熱帶農業(yè)， 2018（6）： 14-16， 19.

程金煥， 何紅艷， 李慧敏， 等. 酶促發(fā)酵在咖啡初加工過程中的應用研究[J]. 安徽農業(yè)科學， 2016， 44（6）： 83-84， 90.