宋瑞龍，徐天祺,梁琰,曹瑩,劉宗平

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州，225009)

骨是一種動(dòng)態(tài)組織，骨重建過(guò)程分為成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，其動(dòng)態(tài)平衡有利于維持機(jī)體內(nèi)正常的骨代謝和血鈣水平[1]。破骨細(xì)胞具有獨(dú)特的骨吸收活性，其主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞。破骨細(xì)胞對(duì)骨骼生長(zhǎng)、發(fā)育、修復(fù)與重建起著至關(guān)重要的作用。破骨細(xì)胞的異常與動(dòng)物機(jī)體骨質(zhì)疏松、骨腫瘤等多種骨科疾病密切相關(guān)[2]。

細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)聚合積極參與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的遷移、識(shí)別與融合，在破骨細(xì)胞分化的過(guò)程中扮演著重要的角色。細(xì)胞骨架是細(xì)胞偽足的重要成分，細(xì)胞偽足可分為板狀偽足與絲狀偽足，其形成主要依賴于肌動(dòng)蛋白的聚合。因此，肌動(dòng)蛋白的異常會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞骨架重塑的紊亂，影響細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理功能，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化異常[3-4]。相反，對(duì)肌動(dòng)蛋白的調(diào)節(jié)可成為調(diào)控破骨細(xì)胞分化的潛在靶點(diǎn)，Rho家族蛋白被證明是肌動(dòng)蛋白的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，Rho與鳥(niǎo)嘌呤三核苷酸(GTP)結(jié)合活化后，對(duì)細(xì)胞外信號(hào)進(jìn)行整合以介導(dǎo)細(xì)胞形狀學(xué)變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)與功能[5-6]。作為Rho家族的重要成員，Cdc42活化后可通過(guò)對(duì)微絲的調(diào)節(jié)參與細(xì)胞骨架的重塑、細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)和細(xì)胞遷移等過(guò)程[5,7]。然而，目前對(duì)Cdc42影響破骨細(xì)胞分化的作用機(jī)理尚未明確。

巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)和核因子κB受體激動(dòng)劑配體(ligand of receptor activator of NF-κB, RANKL)是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化成熟的主要因子[8-9]。本研究擬構(gòu)建Cdc42基因沉默的RAW264.7細(xì)胞，并加入M-CSF和RANKL予以誘導(dǎo)分化，觀察細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)基因以及破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)水平的變化，旨在闡述Cdc42表達(dá)對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響，探討該作用產(chǎn)生的作用機(jī)制，為畜牧養(yǎng)殖中骨科疾病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

小鼠RAW264.7細(xì)胞系源自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑

Cdc42干擾慢病毒顆粒(賽業(yè)生物)；TRAP染色試劑盒(Sigma)；DMEM,α-MEM(Gibco)；胎牛血清(FBS)(GEMINI)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；RANKL和M-CSF(Peprotech)；DAPI染液(碧云天生物)；Trizol(Invitrogen)；熒光定量試劑盒(TaKaRa)；鬼筆環(huán)肽、Rat mAb to Tubulin和Goat pAb to Rat IgG H&L (Alexa Fluor? 488)(Abcam)；RIPA裂解液(普利萊生物)；兔抗GAPDH、Cdc42、Cofilin(Abcam)；兔抗PAK4(Biodragon)。

1.3 Cdc42沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立

將RAW264.7細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中懸浮后，以5×104/孔接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后添加4.3×107TU Cdc42慢病毒顆粒，同時(shí)添加終濃度為5 μg/mL的Polybrene。病毒轉(zhuǎn)染后12 h更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)加入含有終濃度為4 μg/mL的嘌呤霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)液選擇性培養(yǎng)3 d，擴(kuò)增能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞，凍存保種用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 沉默效率的檢測(cè)

采用Trizol裂解法提取Cdc42沉默組與對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，并檢測(cè)其完整性和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，于37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃滅活5 s，獲得的cDNA。取定量cDNA配制成20 μL的熒光定量反應(yīng)體系，于熒光定量PCR儀中測(cè)定其擴(kuò)增及溶解曲線，熒光定量PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s；60 ℃ 31 s；溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。利用2-△△CT的方法，分析不同組之間Cdc42基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色

Cdc42沉默組及對(duì)照組細(xì)胞按8×103/mL懸浮于含50 ng/mL M-CSF、60 ng/mL RANKL、10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液，接種于六孔板，每孔接種2 mL，第3天換液，第4天棄去培養(yǎng)液。參照TRAP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，于100倍倒置顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)與偽足的變化。

1.6 免疫熒光染色

Cdc42沉默以及對(duì)照組細(xì)胞按3.2×103/mL懸浮于含50 ng/mL M-CSF、60 ng/mL RANKL、10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液，接種于放置有爬片的24孔板中，每孔接種1 mL，第3天更換同種培養(yǎng)液，第4天取出爬片，以PBS清洗2-3次，4%的PFA固定，37 ℃ 20 min，PBS沖洗3次，加入抗F-肌動(dòng)蛋白(F-action)與微管蛋白(tubulin)的抗體，冰盒中孵育過(guò)夜。12 h后以PBS沖洗6次, 每次5 min，避光孵育熒光二抗2 h，PBS沖洗6次，每次5 min，DAPI 孵育15 min，PBS沖洗同上，50%甘油封片, 激光共聚焦顯微鏡下觀察Cdc42沉默對(duì)細(xì)胞骨架和偽足的影響。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用1.4中的方法分別提取誘導(dǎo)4 d后細(xì)胞的總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)熒光定量PCR儀以GAPDH為內(nèi)參基因，利用SYBR Green染料法分別對(duì)TRAP、RAK4、Cofilin的相對(duì)表達(dá)含量進(jìn)行測(cè)定，并比較Cdc42沉默組與對(duì)照組之間上述基因的轉(zhuǎn)錄水平。引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR的引物及序列

基因基因號(hào)正向引物反向引物GAPDHGU214026ATGGTGAAGGTCGGTGTGTGAAGGGGTCGTTGATGGCdc42NM_009861CCTTTCTTGCTTGTTGGGACTGCGGCTCTTCTTCGGTTTRAPNM_001102405GGCTACTTGCGGTTTCACTATTCCTTGGGAGGCTGGTCTPAK4NM_027470.3ATCAGCACGCAGACCCAACATGTTCTCAAATTCGTCAAGCCofilinD00472.1ATGTGGGGCAGACTGTGGATTGGAAACTCACACGCCAGAAG

1.8 Western blot檢測(cè)

棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入RIPA裂解液，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，置于冰上裂解20 min，取裂解液，超聲裂解40 s， 4 ℃ 12 000 g離心10 min，取上清。采用BCA法測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度使各組濃度一致。加入4×SDS loading buffer，隔水煮沸5 min。目的蛋白每孔上樣20 uL，以10% SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入GAPDH、Cdc42、Cofilin、PAK4一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST清洗3次，每次5 min，室溫孵育二抗2 h，TBST清洗后顯影。GAPDH作為內(nèi)參，采用Image Lab軟件計(jì)算灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。利用 GraphPadPrism5軟件繪制柱形圖。

2 結(jié)果

2.1 Cdc42慢病毒沉默效果

嘌呤霉素篩選后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較好。Cdc42 mRNA表達(dá)水平極顯著降低，與對(duì)照組相比差異極顯著；Western blot檢測(cè)顯示Cdc42蛋白表達(dá)量顯著下降，見(jiàn)圖1。結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖能力優(yōu)良，生長(zhǎng)穩(wěn)定，該Cdc42慢病毒轉(zhuǎn)染篩選后形成的穩(wěn)轉(zhuǎn)株穩(wěn)定，干擾效率高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A為基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，B為蛋白相對(duì)表達(dá)量，*表示P<0.05，**表示P<0.01，下同

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染后Cdc42沉默效率檢測(cè)

2.2 Cdc42沉默對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

細(xì)胞誘導(dǎo)4d后的TRAP染色結(jié)果(見(jiàn)圖2)顯示Cdc42沉默組未發(fā)現(xiàn)TRAP陽(yáng)性細(xì)胞，相反，對(duì)照組可觀察到大量的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明M-CSF和RANKL成功誘導(dǎo)對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，而Cdc42基因的沉默抑制了破骨細(xì)胞的分化。

2.3 Cdc42沉默對(duì)前體細(xì)胞偽足和骨架的影響

激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，Cdc42沉默組的細(xì)胞呈圓形，較為規(guī)則，基本無(wú)絲狀偽足和板狀偽足，而對(duì)照組可觀察到大量的絲狀偽足(見(jiàn)圖3)，基本具有對(duì)稱分布的板狀偽足。說(shuō)明Cdc42的表達(dá)沉默可引起細(xì)胞骨架形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，影響細(xì)胞板狀偽足和絲狀偽足的形成。

2.4 Cdc42沉默對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

分別提取誘導(dǎo)4 d后的對(duì)照組和Cdc42沉默組細(xì)胞的總mRNA，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組比較，Cdc42沉默組TRAP、PAK4與Cofilin的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)。

A. 對(duì)照組;B. Cdc42沉默細(xì)胞株

圖2 Cdc42基因沉默對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響(100×)(箭頭所指為破骨細(xì)胞)

A. 激光共聚集顯微鏡觀察；B. 絲狀偽足數(shù)量；C. 板狀偽足數(shù)量

圖3 Cdc42基因沉默對(duì)微管和微絲的影響(箭頭所指為絲狀偽足，三角標(biāo)注為板狀偽足)

圖4 Cdc42對(duì)破骨細(xì)胞TRAP(A)，PAK4(B)和Cofilin(C)轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.5 Cdc42沉默對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)志性蛋白表達(dá)水平的影響

分別提取對(duì)照組和Cdc42沉默組細(xì)胞的總蛋白，Western blot檢測(cè)破骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白Cofilin和PAK4的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，Cdc42沉默組PAK4與Cofilin的蛋白表達(dá)水平分別顯著和極顯著下降。

A. Western blot分析；B. Cofilin表達(dá)；C. PAK4表達(dá)

圖5 Cdc42對(duì)破骨細(xì)胞PAK4和Cofilin蛋白表達(dá)的影響

3 討論

破骨細(xì)胞是由造血干細(xì)胞融合分化而來(lái)，是維持機(jī)體骨重建的關(guān)鍵所在。破骨細(xì)胞在M-CSF 和RANKL的共同作用下存活、分化與活化，發(fā)揮骨吸收的作用[10-11]。對(duì)破骨細(xì)胞形成、分化和骨吸收機(jī)理的研究，有助于防治畜牧養(yǎng)殖過(guò)程中所發(fā)生的骨質(zhì)疏松等多種骨科疾病，可有效提高動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

Cdc42是Rho家族的重要成員之一，具有GTP酶活性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的聚合與解聚中起到重要的作用[5,7]。研究表明Cdc42可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)的黏附以及細(xì)胞骨架形成和重組，參與細(xì)胞的遷移、增殖、分化和凋亡[12-13]。為探討Cdc42對(duì)破骨細(xì)胞分化、成熟的影響，本研究首先利用慢病毒技術(shù)干擾RAW264.7細(xì)胞中Cdc42的表達(dá)，同時(shí)我們采用嘌呤霉素對(duì)慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲取生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)良好的細(xì)胞。對(duì)所獲的細(xì)胞用qRT-PCR與Western blot予以鑒定，明確了Cdc42基因在病毒轉(zhuǎn)染組的表達(dá)顯著或極顯著低于對(duì)照組中的表達(dá)水平，證明Cdc42沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)株已構(gòu)建成功。

TRAP是破骨細(xì)胞功能活性和成熟的重要標(biāo)志物，是破骨細(xì)胞在骨吸收過(guò)程中高度表達(dá)的特征性酶[14]。我們利用TRAP染色觀察Cdc42基因沉默對(duì)RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cdc42沉默組細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，未見(jiàn)TRAP陽(yáng)性染色的破骨細(xì)胞，且TRAP的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組極顯著降低。結(jié)合F-action和tubulin的免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)Cdc42的表達(dá)異常極大地抑制了肌動(dòng)蛋白的聚合作用，導(dǎo)致細(xì)胞前緣突起障礙，絲狀偽足與板狀偽足數(shù)量減少。這些結(jié)果說(shuō)明，Cdc42的缺失阻礙了細(xì)胞遷移與融合，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化過(guò)程受阻和發(fā)育不成熟。我們的發(fā)現(xiàn)與之前Melendez等[14]所報(bào)道的類(lèi)似，他們提出Cdc42可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)骨架蛋白的聚合與解聚以參與腫瘤細(xì)胞的的運(yùn)動(dòng)遷移與融合。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)Cdc42基因沉默可引起破骨細(xì)胞中PAK4與Cofilin基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，可能與Cdc42下游信號(hào)通路傳導(dǎo)中斷有關(guān)，有研究顯示Cdc42可激活下游PAK、WASP和ACK等信號(hào)傳導(dǎo)[15-17]。PAKs是一種與人類(lèi)腫瘤相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸(Serine/Threonine，Ser/Thr)激酶，在腫瘤血管生成和細(xì)胞骨架重構(gòu)等多過(guò)程中有重要作用；PAKs家族成員依據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和功能的不同將其分為2 個(gè)亞組：PAK1-3的Ⅰ組與PAK4-6的Ⅱ組[18]。PAK活化則通過(guò)LIM激酶1(LIMK1)的磷酸化促進(jìn)外周肌動(dòng)蛋白的重組，維持肌動(dòng)蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)與運(yùn)動(dòng)[19]。同時(shí)，PAK還可通過(guò)其下游信號(hào)影響Cofilin的活性與肌動(dòng)蛋白絲的穩(wěn)定性。另有研究表明，Cdc42的活化會(huì)引起Rac的局部活化， 活化的Rac可使RhoA被激活。目前對(duì)于Cdc42對(duì)細(xì)胞骨架的影響已經(jīng)提出了兩種機(jī)制，包括它們對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和整聯(lián)蛋白粘附復(fù)合物的作用以及它們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的直接作用等[20]。在破骨細(xì)胞分化形成過(guò)程中，Cdc42的沉默極顯著下調(diào)了PAK4和cofilin的轉(zhuǎn)錄水平，說(shuō)明Cdc42能夠通過(guò)兩者調(diào)控前體細(xì)胞的細(xì)胞骨架和偽足，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的分化和形成。

綜上所述，Cdc42在破骨細(xì)胞分化成熟過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其能經(jīng)細(xì)胞骨架調(diào)控細(xì)胞偽足的形成，最終影響破骨細(xì)胞的分化。