張琳欽，張君，徐尚榮，彭巍，黃 榮，舒適，關(guān)凱文，趙明旺

(1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

中國是飼養(yǎng)牦牛數(shù)量最多的國家，牦牛的養(yǎng)殖大多分布于青藏高原，其在高寒牧區(qū)具有不可替代的生態(tài)、社會、經(jīng)濟地位[1]。但處于青藏高原嚴(yán)酷的環(huán)境下，牦牛的生產(chǎn)性能低下，繁殖性能低下尤其明顯[2]。而在動物生殖發(fā)育進程中，卵巢顆粒細胞一直起著不容忽視的作用。研究牦牛卵巢顆粒細胞，對更好地理解牦牛的生殖機理及進一步提高牦牛繁殖力具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

近年來，對哺乳動物卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)體系的研究和建立已較為成熟[3]。因此，在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，對青海牦牛卵巢顆粒細胞進行體外分離和培養(yǎng)，建立完善的培養(yǎng)體系是十分必要的，顆粒細胞也確實是研究動物卵巢內(nèi)分泌功能及生殖生理學(xué)的一種理想細胞模型[4]。

孕酮(progesterone, P4)在卵泡排卵和黃體形成過程中發(fā)揮作用，能促進子宮機能的成熟，適量的孕酮更有助于雌性動物維持正常性欲和生殖功能[5]。而顆粒細胞的增殖與分化能夠直接影響孕酮的分泌，作為卵泡內(nèi)包裹卵子的細胞群體，它還能夠影響卵泡的發(fā)育、排卵、黃體形成過程及類固醇激素[6]。也有研究證實，體外培養(yǎng)的顆粒細胞可以自發(fā)的分泌孕酮和雌激素，而不需要雄激素作為合成底物[7-8]。

目前，在對生殖啟動的關(guān)鍵因子Kisspeptin的研究中發(fā)現(xiàn)，它的最小活性片段，具有高度物種間保守性的Kisspeptin-10(kp-10)，對顆粒細胞的增殖和孕酮的分泌具有促進作用[9-12]。然而kp-10在牦牛上是否同樣對卵巢顆粒細胞孕酮分泌有調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

本研究分離和培養(yǎng)青海牦牛卵巢顆粒細胞，并在此基礎(chǔ)上探討kp-10對青海牦牛卵巢顆粒細胞孕酮分泌的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

從青海西寧裕泰屠宰場采集剛屠宰的牦牛卵巢，挑選外觀色澤光亮、發(fā)育正常、沒有黃體、有腔卵泡多而飽滿的卵巢，放入裝有37 ℃含雙抗的生理鹽水恒溫保溫杯中，于4 h內(nèi)運回實驗室。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、青鏈霉素混合液(BOSTER)、胰酶(BI)、ITS(Sigma)、Kisspeptin蛋白劑(millipore)、PBS(TRANS)、孕酮試劑盒(Bovine P)、Hoechst33258(Solarbio)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), PE conjugate(TRANS)、FSHR兔多克隆抗體(BOSTER)、即用型正常山羊血清(BOSTER)、Triton-X-100(Solarbio)、Trypan Blue(Solarbio)、4%多聚甲醛(Solarbio)、Fluo-4 AM(Beyotime)。

1.2 方法

1.2.1 青海牦牛卵巢顆粒細胞的分離和培養(yǎng)

在實驗室無菌環(huán)境下，使用預(yù)熱的37 ℃生理鹽水再次清洗采集回的卵巢，并修剪掉采集卵巢時未除掉的多余韌帶、系膜等結(jié)締組織。生理鹽水清洗卵巢3次，然后在超凈臺內(nèi)，使用5 mL注射器抽吸卵巢上2～8 mm卵泡內(nèi)的卵泡液，并集中收集入15 mL無菌離心管中。使用100 μm細胞篩過濾卵泡液以去除卵母細胞，常溫下，離心(1 000 r/min，5 min)。棄上清，加入含1%雙抗的PBS，吹打混勻并清洗細胞3次。離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加入2 mL含胎牛血清的完全培養(yǎng)基，制成單細胞懸液。取100 μL單細胞懸液，再加入等量的臺盼藍染液，進行染色和計數(shù)。將細胞懸液調(diào)整濃度至4×105/mL接種于25 mL的細胞培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液1次。期間，PBS沖洗，去除未貼壁細胞和雜質(zhì)。之后，每48 h換液1次。

1.2.2 FSHR表達鑒定牦牛卵巢顆粒細胞

胰酶消化原代細胞，制備單細胞懸液，將4×105/mL的細胞懸液注入放有8 mm圓形載玻片的35 mm細胞培養(yǎng)皿中，在5% CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞長至貼壁面80%，取出細胞爬片，用PBS沖洗1 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min后，進行細胞免疫化學(xué)染色：固定好的細胞爬片，PBS洗滌1 min×3次；0.4% Triton通透細胞膜10 min，PBS洗滌1 min×3次；即用型正常山羊血清封閉30 min,除液，不用PBS洗滌；加入一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育，過夜；取出細胞爬片，PBS洗滌1 min×3次，加入二抗羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)，室溫，避光1h，PBS洗滌1 min××3次，加入1 mg/L的Hoechst33258，室溫5 min。PBS代替一抗，陰性對照。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 卵巢顆粒細胞HE染色

顆粒細胞培養(yǎng)過程中，分別于6、12、18、24、36、48、72及96 h取出提前放置的細胞爬片，用PBS沖洗1 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS沖洗2次后，蘇木素染色2 min，流水沖去浮色，入鹽酸酒精中分色數(shù)秒，流水沖洗2 min，鏡下細胞核染色清晰，胞漿不著色。5%伊紅染色2 min，流水沖去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片后，光鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.4 CCK法檢測牦牛卵巢顆粒細胞的活力

取顆粒細胞，以6×104/mL接種于96孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)100 μL，在5%CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次選取3個復(fù)孔，于6、12、18、24、36、48、72及96 h加入CCK，避光培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀，測定450 nm的細胞OD值。以含培養(yǎng)基和CCK的無細胞處理組為空白對照。

1.2.5 不同處理時間及不同濃度下kp-10對牦牛卵巢顆粒細胞活性的影響

取顆粒細胞，按6×104/mL接種于96孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)100 μL，在5% CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。細胞貼壁完全，每孔再加入等量的1% ITS培養(yǎng)基(即無血清培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。換無血清培養(yǎng)基穩(wěn)定培養(yǎng)12 h，棄原液。加入含有不同濃度kp-10(0、10、100及1 000 nmol/L)的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞；分別于給藥后12、24、48及72 h加入含CCK的培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀，測定450 nm的細胞OD值。期間，收集適量24 h批次未加CCK的細胞上清，放于-20 ℃凍存，用于孕酮含量檢測。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度

方法同1.2.5，加入不同濃度的kp-10、Verapamil單獨或共同處理細胞24 h后， ELLSA測上清內(nèi)孕酮含量。細胞則通過胰酶消化后，收集并用PBS(無鈣)清洗3遍。加入Fluo-4 AM工作液，室溫孵育60 min。PBS(無鈣)清洗3遍，室溫孵育20 min。最后用PBS(無鈣)制備單細胞懸液，調(diào)整濃度至1×106/mL。于流式細胞儀上檢測，獲取的熒光值，通過流式細胞儀自帶的Cyt Expert軟件分析處理。

1.2.7 ELLSA法檢測孕酮含量

收集各組待測的細胞上清，孕酮水平通過ELLSA法進行測定。測定方法按牛孕酮(P)酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進行。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，得出回歸曲線Y=0.109X-0.000 837，相關(guān)系數(shù)R2=0.996。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中牛孕酮(P)濃度。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 23.0、Graphpad Prism5對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖。每個處理組設(shè)3個重復(fù)，每個試驗重復(fù)3次，測定結(jié)果以x±s表示，細胞活力OD值及孕酮濃度用單因變量多因素方差分析、多重比較LSD檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)細胞的FSHR鑒定

圖1所示，細胞培養(yǎng)24 h后(圖A)，對其進行 FSHR免疫熒光染色。倒置熒光顯微鏡觀察：細胞核被Hoechst333258染成藍色(圖B)，分離、培養(yǎng)的細胞基本都表達FSHR(圖C)，疊加后發(fā)現(xiàn)FSHR陽性細胞與核染完全重合(圖D)，鏡下計數(shù)顯示，表達FSHR陽性細胞>97%，分離培養(yǎng)的細胞確實為牦牛卵巢顆粒細胞。

A.光鏡下培養(yǎng)24 h的細胞 ；B.Hoechst33258細胞核染色；C.細胞的FSHR染色；D.FSHR和Hoechst33258合并圖

2.2 牦牛卵巢顆粒細胞形態(tài)觀察

由圖2可知，牦牛卵巢顆粒細胞在6 h內(nèi)就能貼壁，并在貼壁初期，部分集中聚集生長，細胞在增殖過程中由密集向稀疏部位遷移，至布滿貼壁面，細胞形態(tài)由梭形、多邊形呈放射狀至鋪路板狀再慢慢變?yōu)槌世w維狀。

A.培養(yǎng)6 h顆粒細胞；B.培養(yǎng)12 h顆粒細胞；C.培養(yǎng)18 h顆粒細胞；D.培養(yǎng)24 h顆粒細胞；E.培養(yǎng)36 h顆粒細胞；F.培養(yǎng)48 h顆粒細胞；G.培養(yǎng)72 h顆粒細胞；H.培養(yǎng)96 h顆粒細胞

圖2 牦牛卵巢顆粒細胞HE染色(×100)

2.3 牦牛卵巢顆粒細胞生長活力檢測

CCK是根據(jù)檢測細胞的還原結(jié)果來反映細胞的活力和增殖情況。分別于6、12、18、24、36、48、72及96 h檢測細胞活力。結(jié)果(圖3)可見，細胞生長曲線呈“S”型，在24 h內(nèi)處于潛伏期，6 h至12 h至18 h差異皆不顯著(0.11±0.01vs0.11±0.01vs0.11±0.01,P>0.05)。培養(yǎng)24 h至72 h，細胞進入對數(shù)生長期，18 h至24 h至36 h至48 h至72 h差異皆顯著(0.11±0.01vs0.15±0.02vs0.35±0.01vs0.46±0.03vs0.61±0.01,P<0.05),72 h至96 h差異不顯著(0.61±0.01vs0.62±0.01,P>0.05)，根據(jù)測得OD值結(jié)果，推斷細胞已長滿細胞培養(yǎng)孔，進入平臺期。以上結(jié)果表明，牦牛卵巢顆粒細胞符合貼壁細胞的生長規(guī)律，細胞培養(yǎng)狀態(tài)良好[13]。

2.4 不同處理時間及不同濃度的Kisspeptin-10對牦牛卵巢顆粒細胞活力的影響

圖4顯示，10和100 nmol·L-1kp-10處理12 h均顯著提高顆粒細胞的活力(0.64±0.02vs0.58±0.03，0.69±0.02vs0.58±0.03，P<0.05)，1 000 nmol·L-1kp-10處理12 h，細胞活力被顯著抑制(0.51±0.03vs0.58±0.03，P<0.05)；10、100和1 000 nmol·L-1kp-10處理24 h、48 h、72 h均顯著提高顆粒細胞的活力，100 nmol·L-1kp-10效果最佳(24 h:0.77±0.02vs0.59±0.01, 0.85±0.01vs0.59±0.01,0.74±0.03vs0.59±0.01;48 h:0.92±0.01vs0.62±0.01, 1.28±0.03vs0.62±0.01, 1.05±0.06vs0.62±0.01; 72 h: 1.5±0.01vs0.66±0.01, 1.6±0.01vs0.66±0.01, 1.56±0.01vs0.66±0.01，P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖3 CCK檢測牦牛卵巢顆粒細胞活性

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖4 Kisspeptin-10不同處理時間及濃度對牦牛卵巢顆粒細胞CCK影響

2.5 不同濃度Kisspeptin-10對牦牛卵巢顆粒細胞孕酮分泌的影響

圖5顯示，與對照組相比，10、100和1 000 nmol·L-1kp-10處理24 h時均顯著提高顆粒細胞孕酮的分泌,并且在100 nmol·L-1時最顯著。(0.22±0.01vs0.16±0.01, 0.25±0.01vs0.16±0.01, 0.22±0.01vs0.16±0.01, 0.25±0.01vs0.22±0.01,P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖5 不同濃度Kisspeptin-10對牦牛卵巢顆粒細胞孕酮分泌的影響

2.6 Verapamil對Kisspeptin-10促牦牛卵巢顆粒細胞孕酮分泌的作用及胞內(nèi)Ca2+濃度變化

由圖6可知，鈣離子阻斷劑Verapamil會降低孕酮的分泌，于20、50 nmol·L-1時，達顯著降低水平(0.233±0.004vs0.252±0.007；0.225±0.005vs0.252±0.007，P<0.05)；不同濃度的Verapamil與100nmol·L-1kp-10共同處理時，孕酮含量有所提升，但不能逆轉(zhuǎn)其對孕酮分泌的抑制作用(0.249±0.008vs0.257±0.004；0.233±0.004vs0.234±0.004；0.225±0.005vs0.23±0.003，P>0.05)。

用流式細胞儀檢測胞內(nèi)Ca2+濃度，數(shù)據(jù)通過Cyt Expert軟件分析，其結(jié)果與圖6中Verapamil和Kisspeptin-10單獨或共同處理牦牛卵巢顆粒細胞后孕酮分泌水平相一致(圖7)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖6 Verapamil對Kisspeptin-10促牦牛卵巢顆粒細胞孕酮分泌的影響

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖7 Kisspeptin-10和Verapamil對牦牛卵巢顆粒細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

3 討論

本試驗在參考了近些年國內(nèi)外對顆粒細胞的培養(yǎng)方法后，建立了青海牦牛卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)體系，并通過FSHR抗體對牦牛卵巢顆粒細胞進行鑒定。FSHR是位于性腺上的卵泡刺激素特異性受體，在卵泡內(nèi)，F(xiàn)SHR僅存在于顆粒細胞上，其mRNA位于顆粒細胞的表面[14]。針對使用動物血清所要面臨的內(nèi)外源病毒、細菌和支原體等微生物污染的風(fēng)險[15]，本試驗在使用血清培養(yǎng)青海牦牛卵巢顆粒細胞的基礎(chǔ)上，逐步建立無血清培養(yǎng)體系。

Kisspeptin可水解為Kisspeptin-54，14，13，10，其共同特點是羧基端為精氨酸-苯丙氨酸-NH2(RF- NH2)模體，都能與GPR54以相似親和力特異性結(jié)合，其中Kisspeptin-10是其最小活性片段，具有高度的物種間保守性[16]。本試驗結(jié)果表明， kp-10和孕酮分泌呈劑量依懶性增加，這與劉羽紅等[9]的研究結(jié)果相一致。但本試驗中1 000 nmol·L-1kp-10處理12 h時，顆粒細胞活力被顯著抑制，參考王軍等[17]發(fā)表的Kisspeptin對牛卵巢顆粒細胞凋亡的影響研究，推測可能是因為培養(yǎng)短時間，該濃度kp-10對顆粒細胞凋亡的作用明顯，故而導(dǎo)致檢測時OD值低于對照組。在1 000 nmol·L-1kp-10處理24、48及72 h時，顆粒細胞活力顯著提高，結(jié)合郭威等[10]、肖蘊琪等[11]的研究結(jié)果，推斷隨著時間的推移，kp-10在促進細胞凋亡過程中也同時起到促進細胞增殖的作用，其對細胞增殖的影響大于對細胞凋亡的促進作用，具體機理，仍需進一步研究。

苯烷基胺類鈣通道拮抗劑Verapamil可以作用于細胞膜上的鈣通道，阻斷胞外Ca2+內(nèi)流[18]。本試驗使用不同劑量的Verapamil單獨或與100 nmol·L-1Kisspeptin-10共同處理牦牛卵巢顆粒細胞，試驗結(jié)果驗證了kp-10促進顆粒細胞孕酮分泌的作用可能依賴于胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

4 結(jié)論

綜上所述，體外培養(yǎng)青海牦牛卵巢顆粒細胞，建立細胞模型，是理想且可行的。Kisspeptin-10在100 nmol·L-1時效果最佳，可增強青海牦牛卵巢顆粒細胞的活力，促進顆粒細胞孕酮的分泌，Kisspeptin-10促進孕酮分泌的作用可能與胞內(nèi)Ca2+信號通路有關(guān)。