衡友強(qiáng) 游西龍 王 艷

費(fèi)爾干豬毛菜病程相關(guān)蛋白基因的異源表達(dá)增強(qiáng)了煙草對(duì)干旱、鹽及葉斑病的抗性

衡友強(qiáng) 游西龍 王 艷*

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/ 新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆烏魯木齊 830046

為明確一年生草本鹽生植物費(fèi)爾干豬毛菜(Drob)病程相關(guān)蛋白基因(GenBank登錄號(hào)為JQ670917)是否參與了植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng), 采用qRT-PCR檢測(cè)了該基因在不同組織部位和脫落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前體(ACC)等相關(guān)激素脅迫及NaCl處理下的表達(dá)規(guī)律, 同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草在鹽、旱及丁香假單胞菌等脅迫下的抗性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示,基因在費(fèi)爾干豬毛菜根中的表達(dá)量顯著高于莖葉中, 且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的積極誘導(dǎo); 干旱脅迫下, 轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛(MDA)含量顯著低于野生型煙草, 顯示出較強(qiáng)的抗旱表型; 鹽脅迫下, 異源表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長(zhǎng)顯著優(yōu)于野生型煙草; 丁香假單胞菌攻毒后的轉(zhuǎn)基因煙草葉片呈現(xiàn)嚴(yán)重的壞死反應(yīng), 但植株的整體抗性表型顯著優(yōu)于野生型煙草; 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白定位于植物細(xì)胞質(zhì)外體空間。以上結(jié)果表明, 費(fèi)爾干豬毛菜病程相關(guān)蛋白基因參與了植物對(duì)非生物及生物脅迫的抗性。

病程相關(guān)蛋白基因; 表達(dá)規(guī)律; 轉(zhuǎn)基因煙草; 抗性功能; 亞細(xì)胞定位

鹽、堿、干旱和病原微生物等外界脅迫已經(jīng)成為影響農(nóng)作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。為解決日益增長(zhǎng)的人口與糧食短缺之間的矛盾, 通過(guò)基因工程手段挖掘并利用抗逆植物的基因資源是改良農(nóng)作物農(nóng)藝性狀的有效手段之一。當(dāng)植物感知外界脅迫時(shí)會(huì)迅速產(chǎn)生次級(jí)信號(hào)如茉莉酸(JAs)[1-3]、乙烯(ET)[4-5]、水楊酸(SA)[6]、過(guò)氧化氫(H2O2)[7]等, 從而在體內(nèi)產(chǎn)生復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò), 誘導(dǎo)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗性功能。病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)是一類被生物和非生物脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白總稱, 在植物的防御體系中發(fā)揮重要作用[8-12]。目前在真菌[13-14]和動(dòng)物[15]中也發(fā)現(xiàn)了該蛋白的同源物。依據(jù)PRs的分子量、空間結(jié)構(gòu)以及血清學(xué)關(guān)系, 病程相關(guān)蛋白被分成17個(gè)亞家族[16-17], 并命名為PR1~PR17, 其中最早發(fā)現(xiàn)的是煙草病程相關(guān)蛋白TaPR1[10]。PR1亞家族因其序列保守、種類繁多、功能強(qiáng)大等特點(diǎn)成為備受關(guān)注的一類病程相關(guān)蛋白。編碼該蛋白的基因往往受到細(xì)菌[18-19]、病毒[20]、真菌[21]等生物脅迫和鹽、旱等非生物脅迫[22-23]的誘導(dǎo), 暗示其可能在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用, 因而常常作為植物系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)的標(biāo)記基因[18]。

費(fèi)爾干豬毛菜(Drob.)屬C4藜科雙子葉一年生草本植物, 主要分布在我國(guó)新疆北部的鹽堿化土壤區(qū)域, 其整個(gè)生長(zhǎng)周期處于嚴(yán)重鹽漬、干旱等復(fù)雜的惡劣生境, 是極具生態(tài)和研究?jī)r(jià)值的泌鹽鹽生植物[24]。然而, 目前對(duì)費(fèi)爾干豬毛菜發(fā)揮抗性功能的分子機(jī)制仍知之甚少。本課題小組前期從費(fèi)爾干豬毛菜中克隆獲得了一個(gè)鹽響應(yīng)的病程相關(guān)蛋白基因[22], 本研究擬利用qRT-PCR技術(shù)探究該基因在費(fèi)爾干豬毛菜不同組織、不同植物激素及鹽脅迫下的表達(dá)模式, 同時(shí)通過(guò)對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化明確其對(duì)生物和鹽、旱等非生物脅迫的抗性功能, 為解析該基因的抗性分子機(jī)制及費(fèi)爾干豬毛菜的抗性機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 將采自新疆吉木薩爾縣古爾班通古特沙漠的費(fèi)爾干豬毛菜種子去除種翅后經(jīng)0.1%升汞(氯化汞)表面消毒8 min, 無(wú)菌水反復(fù)沖洗, 直至去除表面殘留升汞(約5~6次)后備用。于正常MS培養(yǎng)基中萌發(fā)生長(zhǎng)20 d后轉(zhuǎn)移至不同脅迫條件的MS培養(yǎng)基中處理, 取處理不同時(shí)間的費(fèi)爾干豬毛菜互生前四節(jié)莖葉和根作為總RNA的提取材料。煙草(L.)品種W38由北京林業(yè)大學(xué)贈(zèng)送, 以55~60 d左右的煙草無(wú)菌苗葉片為轉(zhuǎn)化受體材料。平均培養(yǎng)溫度25℃, 光照時(shí)間16 h d-1, 黑暗8 h d-1, 相對(duì)濕度40%。以無(wú)菌生長(zhǎng)50 d再土培25 d長(zhǎng)勢(shì)大小基本一致的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行鹽、干旱和生物攻毒處理。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒及試劑 大腸桿菌() DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買于北京全式金生物技術(shù)有限公司; 丁香假單胞菌(tomato DC3000)由中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所惠贈(zèng); 植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure Tissue Kit購(gòu)于美國(guó)Omega BioTek公司, RNA-Free DNase I購(gòu)自天根生物科技有限公司; Prime Scrip II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司; 實(shí)時(shí)熒光定量試劑Power SYBRGreen PCR Master Mix購(gòu)自ABI公司; 茉莉酸JAs、脫落酸ABA、潮霉素和卡那霉素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司; 乙烯合成前體ACC購(gòu)自Calbiochem公司; PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 SfPR1a蛋白的同源性比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他物種中的PR1氨基酸序列, 用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析及保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.3 SfPR1a基因的表達(dá)

將MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)20 d的費(fèi)爾干豬毛菜幼苗分別移至含有終濃度為50 μmol L-1ABA、50 μmol L-1ACC、100 μmol L-1JAs和600 mmol L-1NaCl的MS固體培養(yǎng)基上脅迫處理, 分別取處理1、6、24 h的莖葉混合樣品, 依照試劑盒說(shuō)明書并結(jié)合RNA-Free DNaseI試劑提取不同組織部位和不同脅迫處理下的總RNA, 采用Nano DropND-1000分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的濃度及純度, 合成第1條cDNA鏈。隨后參照說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Applied Biosystems Interface 7500)。以費(fèi)爾干豬毛菜(上游引物P1: 5'-AAGATCTGGCACCACACCTTC-3'; 下游引物P2: 5'-CACACCATCACCAGAATCGA-3')為內(nèi)參基因,基因(GenBank登錄號(hào)為JQ 670917)特異性引物,P1 (5￠-CCAACCAA AGGAAGGGCGA-3￠)和P2 (5￠-CACACACC TTATTGGCGGCA-3￠)。反應(yīng)體系含10 μL SYBRPremix、2 μL cDNA模板、0.5 μL正/反向引物、0.4 μL Rox、加蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s; 95℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。設(shè)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2–DDCt法處理數(shù)據(jù), 利用Prism 5.0軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及分子鑒定

采用反復(fù)凍融法將課題組前期構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMIA1301-1-SfPR1a[25]轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHAl05, 利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草[26]。通過(guò)終濃度為20 mg L-1潮霉素的兩代篩選, 獲得T2代純系轉(zhuǎn)基因煙草。以煙草基因?yàn)閮?nèi)參基因[27](上游引物P1: 5￠-AGGTGGAGACATGGGTGGTG-3￠; 下游引物P2: 5￠-TCATTAGGCACACAGA TCTCTG-3￠), 通過(guò)qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因煙草中基因的表達(dá), 具體方法同1.3。

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱能力分析

將無(wú)菌生長(zhǎng)50 d的煙草幼苗移至花土︰蛭石︰珍珠巖=3︰1︰1的基質(zhì)中于16 h光照/8 h黑暗光周期下培養(yǎng)25 d, 對(duì)長(zhǎng)勢(shì)基本一致的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行自然控水干旱處理2周。MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物, 其含量可反映植物細(xì)胞在干旱脅迫下的受損程度。取第四輪葉片(從下到上)測(cè)定丙二醛(MDA)含量[28]; 控水2周后復(fù)水1周, 統(tǒng)計(jì)植株存活率。每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)5株苗。

1.6 轉(zhuǎn)基因煙草種苗抗鹽能力分析

將表面消毒滅菌的野生型與轉(zhuǎn)基因型煙草種子分別播于正常和含有200 mmol L-1NaCl的MS固體培養(yǎng)基中, 15 d后觀察煙草種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)情況, 同時(shí)測(cè)定相對(duì)生長(zhǎng)量。正常MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)15 d的煙草幼苗重, 記為W1, 200 mmol L-1NaCl脅迫處理下生長(zhǎng)相同天數(shù)的煙草重, 記為W2, 相對(duì)生長(zhǎng)量(relative growth yield, RGY) 的計(jì)算公式為(W1-W2)/W1× 100%。

對(duì)無(wú)菌生長(zhǎng)50 d再土培25 d長(zhǎng)勢(shì)大小基本一致的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草以50 mmol L-1NaCl為濃度梯度每隔4 h進(jìn)行一次鹽澆處理, 直至NaCl濃度為200 mmol L-1, 處理2周, 測(cè)定葉綠素和可溶性蛋白[29-30]含量。

1.7 轉(zhuǎn)基因煙草抗葉斑病能力的分析

丁香假單胞菌tDC3000在含有50 mg L-1利福平的LB液體培基中28℃ 200轉(zhuǎn) min-1條件下過(guò)夜培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8, 離心收集菌體, 用10 mmol L-1MgCl2重懸至終濃度為0.1備用。按照Lee等[31]的方法接種丁香假單胞菌, 小心地將葉片翻過(guò)來(lái)露出背軸面。用不帶針頭的1 mL注射器對(duì)準(zhǔn)煙草葉背面, 將稀釋的菌液通過(guò)壓力滲透的作用進(jìn)入葉片間隙, 隨后覆上保鮮膜保濕, 于25℃、70%相對(duì)濕度, 光照16 h/黑暗8 h的溫室中培養(yǎng)。分別在10 d和45 d后對(duì)接種的煙草葉片照相記錄, 按照Gao等[32]的方法用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)葉面菌斑面積, 觀察攻毒60 d后煙草的整體生長(zhǎng)狀況。

1.8 SfPR1a的亞細(xì)胞定位

利用生物信息學(xué)網(wǎng)站(https://psort.hgc.jp/form2. html)對(duì)SfPR1a蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè), 隨后將目的基因偶聯(lián)綠色熒光蛋白的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體pCAMIA1302-和空載對(duì)照pCAMIA 1302通過(guò)基因槍法轟擊洋蔥表皮[33], 18 h后徒手撕片, 激光掃描共聚焦顯微鏡(Nikon, JPN)觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Prism 5.0軟件對(duì)所記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析, 每組數(shù)據(jù)均由3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)計(jì)算獲得。不同字母表示有顯著性差異,<0.05表示差異顯著,<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SfPR1a蛋白氨基酸序列生物信息學(xué)分析

將費(fèi)爾干豬毛菜SfPR1a與水稻、大豆、青稞和橡膠樹的PR1氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同物種間PR1中相同的氨基酸序列高達(dá)60%以上, 并且在其C端都具有PR1蛋白家族所共有的CAP保守結(jié)構(gòu)域(CXYXPXXGNXXGXXPY)(圖1), 表明費(fèi)爾干豬毛菜基因編碼的蛋白屬于PR1蛋白家族成員。

2.2 SfPR1a基因的表達(dá)規(guī)律

基因在根中的相對(duì)表達(dá)量比莖葉高約200倍(圖2-A)。為明確該基因是否受植物激素和NaCl的誘導(dǎo), 分別用50 μmol L-1ABA、50 μmol L-1ACC、100 μmol L-1JAs和600 mmol L-1NaCl處理20 d齡的費(fèi)爾干豬毛菜幼苗, 分別提取處理0、1、6和24 h幼苗莖葉的總RNA, 進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示, ABA脅迫處理1 h后基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高, 盡管處理6 h后稍有下降但仍顯著高于對(duì)照組, 在24 h表達(dá)量達(dá)到峰值, 增長(zhǎng)約250倍(圖2-B)。費(fèi)爾干豬毛菜幼苗經(jīng)乙烯合成前體ACC處理后,基因呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 但表達(dá)量均顯著高于處理前, 其中處理后6 h表達(dá)量最高, 增長(zhǎng)約4500倍(圖2-C)。基因在100 μmol L-1JAs處理后的表達(dá)趨勢(shì)與ACC處理基本一致, 但整體表達(dá)差異倍數(shù)相對(duì)較低(圖2-D)。600 mmol L-1NaCl處理下,基因呈現(xiàn)早期1 h積極應(yīng)答, 6 h達(dá)到峰值, 表達(dá)量增長(zhǎng)了約40倍, 脅迫24 h后與對(duì)照無(wú)顯著差異(圖2-E)。以上結(jié)果表明費(fèi)爾干豬毛菜基因受到ACC、JAs等生物脅迫相關(guān)激素和ABA等非生物脅迫相關(guān)激素的誘導(dǎo)表達(dá), 同時(shí)也受到非生物脅迫NaCl的誘導(dǎo)表達(dá), 與前期研究結(jié)果趨勢(shì)一致。以上結(jié)果為后期進(jìn)一步研究基因的生物和非生物脅迫抗性功能提供了理論基礎(chǔ)。

圖1 費(fèi)爾干豬毛菜SfPR1a蛋白與其他PR1蛋白家族成員的比較

不同物種PR1蛋白GenBank登錄號(hào): 水稻(AJR16763.1)、大豆(XP003545775.1)、青稞(CAA79703.1)、橡膠樹(ALS87256.1)、費(fèi)爾干豬毛菜(AFR90191.1)。

GenBank accession numbers of different species:Group(AJR16763.1),(XP003545775.1),(CAA79703.1),(ALS87256.1), and(AFR90191.1).

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及鑒定

為明確基因的功能, 采用葉圓盤法轉(zhuǎn)化模式植物煙草, 用終濃度20 mg L-1的潮霉素對(duì)再生的轉(zhuǎn)化煙草及種子進(jìn)行兩代的篩選, 獲得3株T2代純系轉(zhuǎn)基因煙草。利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了基因在轉(zhuǎn)基因煙草OE4、OE5和OE10不同株系中的表達(dá)(圖3), 后期將它們作為基因功能驗(yàn)證的試驗(yàn)材料。

圖2 SfPR1a基因在費(fèi)爾干豬毛菜不同組織部位以及不同處理下的表達(dá)分析

基因在莖葉和根中(A)、ABA (B)、ACC (C)、JAs (D)以及NaCl (E)處理下的相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 不同字母表示存在顯著差異(0.05)。

The relative expression ofgene in aerial part and root (A) and under the conditions of ABA (B), ACC (C), JAs (D), and NaCl (E), respectively. Three biological replicates were set for each experiment. Bars labelled with different letters are significantly different at< 0.05.

圖3 SfPR1a基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)分析

標(biāo)以不同小寫字母的柱值差異顯著(< 0.05)。

Bars labelled with different letters are significantly different at< 0.05.

2.4 轉(zhuǎn)SfPR1a煙草抗旱性分析

對(duì)長(zhǎng)勢(shì)大小一致的煙草進(jìn)行自然控水處理2周, 轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片均呈現(xiàn)不同程度的萎蔫, 但轉(zhuǎn)基因煙草葉片的萎蔫和失水程度較輕于野生型煙草(圖4-A)。測(cè)定結(jié)果顯示, 干旱脅迫后野生型煙草MDA含量顯著增加, 而轉(zhuǎn)基因植株中其含量變化差異不大(圖4-B), 表明相同脅迫條件下野生型煙草受到了嚴(yán)重的膜損傷。野生型和轉(zhuǎn)基因型煙草控水4周復(fù)水1周后, 轉(zhuǎn)基因煙草植株的生長(zhǎng)狀況(圖4-C)及存活率(圖4-D)顯著優(yōu)于野生型煙草。以上結(jié)果表明, 費(fèi)爾干豬毛菜基因的異源表達(dá)顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性。

圖4 轉(zhuǎn)SfPR1a基因煙草在干旱脅迫下的抗性

A: 干旱脅迫處理2周后的煙草生長(zhǎng)表型; B: 干旱脅迫處理2周后的煙草MDA含量變化; C: 干旱脅迫處理4周復(fù)水1周后的煙草生長(zhǎng)表型; D: 干旱脅迫處理4周復(fù)水1周后的煙草存活率統(tǒng)計(jì)。圖中不同小寫字母間表示存在顯著性差異(0.05)。

A: phenotype of tobacco under drought stress treatment for two weeks; B: MDA content of tobacco under for two weeks drought treatment; C: phenotype of tobaccos under drought stress for four weeks and then re-water for one week. D: survival rate (D) of tobaccos under drought stress for four weeks and then re-water for one week. Bars labelled with different letters are significantly different at0.05.

2.5 轉(zhuǎn)SfPR1a基因煙草抗鹽性分析

將表面消毒滅菌的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草種子分別播種于正常MS培養(yǎng)基和含有200 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)15 d。觀察發(fā)現(xiàn), 除OE10株系外, 在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草的種子萌發(fā)情況和生長(zhǎng)表型沒有明顯差異(圖5-A左), 而鹽脅迫條件下3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)均顯著優(yōu)于野生型煙草(圖5-A右), 尤其是萌發(fā)勢(shì)較差的過(guò)表達(dá)株系OE10。同時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下積累的生物量要顯著高于野生型煙草(圖5-B)。成苗階段, 經(jīng)200 mmol L-1NaCl脅迫處理2周后, 野生型煙草出現(xiàn)了一定程度的萎蔫(圖5-C), 而轉(zhuǎn)基因煙草未表現(xiàn)出任何脅迫狀態(tài), 但二者的葉綠素含量和可溶性蛋白含量等生理生化指標(biāo)卻無(wú)顯著性差異(數(shù)據(jù)未顯示)。以上結(jié)果表明,基因的異源表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。

圖5 轉(zhuǎn)SfPR1a基因煙草在鹽脅迫下的抗性

200 mmol L–1NaCl脅迫下的煙草萌發(fā)生長(zhǎng)表型(A)及相對(duì)生長(zhǎng)量(B); 250 mmol L–1NaCl脅迫下的煙草成苗抗鹽表型(C)。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值差異顯著(0.05)。

The phynotypic growth of tobaccos after germination (A) and relative growth in 200 mmol L–1NaCl medium (B); C: tolerance of tobacco at the adult stage under 250 mmol L–1NaCl for 2 weeks. Bars labelled with different letters are significantly different at0.05

2.6 轉(zhuǎn)SfPR1a基因煙草抗葉斑病分析

為明確費(fèi)爾干豬毛菜病程相關(guān)蛋白基因是否能夠提高植株的抗病能力, 對(duì)長(zhǎng)勢(shì)和大小基本一致的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片注射了丁香假單胞菌tDC3000。接種10 d后, 兩者葉片的菌斑面積沒有明顯差異(圖6-A); 接種45 d后, 野生型煙草的菌斑面積沒有顯著性變化, 而轉(zhuǎn)基因煙草葉片的菌斑面積顯著高于野生型煙草(圖6-B和圖6-C)。接種60 d后轉(zhuǎn)基因煙草的整體生長(zhǎng)狀況顯著優(yōu)于野生型煙草(圖6-D)。以上結(jié)果表明基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)葉斑病的抗性。

2.7 亞細(xì)胞定位

生物信息學(xué)分析基因編碼的蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽序列, 屬于分泌型蛋白, 提示該蛋白定位表達(dá)在胞外。利用基因槍法將目的基因與綠色熒光蛋白基因偶聯(lián)的表達(dá)質(zhì)粒和僅含有綠色熒光蛋白基因的空載對(duì)照轟擊至洋蔥表皮中瞬時(shí)表達(dá), 轉(zhuǎn)化18 h后徒手撕片, 用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光以確定目的蛋白在細(xì)胞中的分布。轉(zhuǎn)有綠色熒光蛋白空載對(duì)照pCAMBIA1302-的洋蔥表皮中, 整個(gè)細(xì)胞都有綠色熒光的分布, 無(wú)明顯的細(xì)胞表達(dá)特異性(圖7-A)。而在轉(zhuǎn)有融合目的基因pCAMBIA1302--的洋蔥表皮中, 綠色熒光包圍整個(gè)細(xì)胞, 胞質(zhì)及胞內(nèi)其他細(xì)胞器中并無(wú)分布(圖7-B~D)。結(jié)合理論預(yù)測(cè)和初步試驗(yàn)結(jié)果, 推測(cè)SfPR1a蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞的質(zhì)外體空間, 這可能與其抗性功能的發(fā)揮密切相關(guān)。

3 討論

本試驗(yàn)顯示,基因在費(fèi)爾干豬毛菜地上和地下部分均有表達(dá)(圖2-A), 與Linthorst等[34]證明煙草和矮牽牛基因表達(dá)結(jié)果一致。基因在根中的表達(dá)量顯著高于在地上部分中, 這可能與根作為最先接觸并感知外界土壤刺激的植物器官以應(yīng)對(duì)不利環(huán)境有著密切的關(guān)系。

早期研究發(fā)現(xiàn), 水稻和基因受茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、蛋白酶抑制劑斑蝥素和稻瘟病菌()的顯著誘導(dǎo)表達(dá)[35-37]; Wang等[38]和Gao等[39]的研究結(jié)果也同樣顯示了百合和小麥基因受脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯(EH)的誘導(dǎo)表達(dá)。本研究結(jié)果也顯示基因受生物脅迫相關(guān)激素ACC、JAs及非生物脅迫相關(guān)激素ABA和鹽的脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 推測(cè)該基因可能是多種信號(hào)通路交叉對(duì)話的下游靶基因, 后期仍需對(duì)基因啟動(dòng)子及調(diào)節(jié)機(jī)制做進(jìn)一步的深入研究。

圖6 轉(zhuǎn)SfPR1a基因煙草對(duì)葉斑病的抗性

A: 接菌10 d后煙草葉片菌斑面積; B: 接菌45 d后的煙草葉片; C: 接菌45 d后煙草葉片菌斑面積; D: 接菌60 d后煙草植株的生長(zhǎng)表型。圖中標(biāo)以不同小寫字母的柱值差異顯著(0.05)。

A: plaque area after inoculation offor 10 d; B: tobacco leaves inoculated withfor 45 d; C: plaque area after inoculation offor 45 d; D: growth phenotype of tobaccos after 60 d ofinoculation. Bars labelled with different letters are significantly different at0.05

圖7 SfPR1a的亞細(xì)胞定位

A: 空載對(duì)照mGFP的熒光圖; B: 融合蛋白SfPR1a-mGFP的熒光圖; C: 明場(chǎng)下的圖B; D: 熒光圖B與明場(chǎng)圖C的疊加效果圖。

A: control empty plasmid (GFP) viewed under fluorescence filter; B: SfPR1a-mGFP transformed cells viewed under fluorescence filter (B) to show the location of GFP protein; C: SfPR1a-mGFP transformed cells shape under bright field; D: merge of B and C. Bar = 50 μm.

基因提高了煙草對(duì)鹽和干旱脅迫的抗性,這與之前對(duì)來(lái)自煙草[40]和擬南芥[41]PR1蛋白分別具有抗?jié)B透和干旱脅迫的研究結(jié)果一致。值得注意的是,基因的異源表達(dá)顯著地提高了煙草在種子萌發(fā)階段的生長(zhǎng), 而對(duì)具有抗鹽表型的成苗進(jìn)行葉綠素和蛋白含量進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè)時(shí), 轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草之間沒有顯著差異(結(jié)果未顯示), 該蛋白發(fā)揮生理功能的機(jī)制尚不明確。

煙草[42]和小麥[43]基因的異源表達(dá)增強(qiáng)了植物對(duì)病原微生物的抗性。本研究中, 接種丁香假單胞菌后, 轉(zhuǎn)基因煙草葉片顯示出比野生型煙草葉片更加嚴(yán)重的病理反應(yīng), 但縱觀兩者的表型, 轉(zhuǎn)基因煙草的整體生長(zhǎng)狀況顯著優(yōu)于野生型煙草。有文獻(xiàn)報(bào)道稱[44], 擬南芥基因通過(guò)誘導(dǎo)其他PR家族成員的表達(dá)誘發(fā)了植物的SAR反應(yīng), 從而賦予擬南芥對(duì)丁香假單胞菌的抗性。作為SAR的具體表現(xiàn)之一, 超敏反應(yīng)(hypersensitivity)和過(guò)敏性壞死反應(yīng)(chypersensitive necrosis reaction)均會(huì)通過(guò)感染部位葉片迅速死亡的植物免疫過(guò)程達(dá)到抗菌作用。因此, 推測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草可能通過(guò)異源表達(dá)的誘發(fā)了植株在感染部位的過(guò)敏性壞死反應(yīng)或超敏反應(yīng)導(dǎo)致感染部位葉片迅速死亡, 從而有效抑制病原菌在植物體內(nèi)的擴(kuò)散, 這可能是提高植物抗病性的有效策略之一。然而, Lincoln等[45]研究發(fā)現(xiàn), 番茄PR1蛋白通過(guò)結(jié)合Rac1復(fù)合物以抑制細(xì)胞程序性死亡(PCD), 從而保護(hù)植物在病原體感染后正常生長(zhǎng)。Wang等[38]的研究表明, PR1蛋白在SAR的過(guò)程中通過(guò)與LhSorTGA2蛋白相互作用以調(diào)節(jié)其他防御相關(guān)基因的表達(dá), 從而提高了植物在病原微生物感染過(guò)程中的抗性功能。綜上所述, 不同來(lái)源的植物PR1蛋白在植物抗病過(guò)程中通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮了抗生物脅迫功能。此外, 有研究顯示植物可通過(guò)釋放NO增強(qiáng)PR1蛋白的含量從而減少病原菌在葉片中的積累[47], 推測(cè)基因的表達(dá)可能與無(wú)機(jī)信號(hào)分子之間存在普遍的聯(lián)系; Lu等[43]研究發(fā)現(xiàn)同一物種中不同的PR1蛋白以不同的形式存在, 如小麥的PR1-1主要以單體存在, 而PR1-5以二聚體存在, 該現(xiàn)象與PR1蛋白發(fā)揮作用之間的內(nèi)在聯(lián)系也值得我們進(jìn)一步研究; 根據(jù)Tosarini等[47]的研究發(fā)現(xiàn), 可可中發(fā)現(xiàn)的2種PR1蛋白TcPR-1g和TcPR-1f均具有23個(gè)疏水性氨基酸形成的受體樣激酶保守結(jié)構(gòu)域, 暗示PR1蛋白生物學(xué)功能的發(fā)揮可能與激酶信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。以上研究結(jié)果極大豐富了我們對(duì)PR1蛋白抗病機(jī)理的認(rèn)識(shí)。

結(jié)合亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和本研究結(jié)果, 初步確定SfPR1蛋白可能作為一種分泌型蛋白定位在胞外, 這一結(jié)果與擬南芥AtPR1蛋白的定位結(jié)果相一致[48]。PR1作為一種受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì), 其亞細(xì)胞定位必然與防御功能的發(fā)揮密切相關(guān)。Gao等[37]的研究表明, 定位表達(dá)在胞外的可可TcPR1蛋白具有抑制真菌生長(zhǎng)的作用。目前, 盡管PR1蛋白發(fā)揮抗菌作用的分子機(jī)制尚不清楚, 但可以明確的是來(lái)自不同物種的PR1蛋白在植物抵御生物脅迫抗性過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用。

4 結(jié)論

費(fèi)爾干豬毛菜病程相關(guān)蛋白基因在根中的表達(dá)高于在地上莖葉中, 且該基因受到生物脅迫相關(guān)激素ACC、JAs以及非生物脅迫相關(guān)激素ABA和NaCl的顯著誘導(dǎo); 其異源表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽、旱及丁香假單胞菌的抗性。SfPR1a可能定位表達(dá)在細(xì)胞外, 屬分泌型蛋白。

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Pathogenesis-related protein genefromenhances the resistances to drought, salt and leaf spot disease in transgenic tobacco

HENG You-Qiang, YOU Xi-Long, and WANG Yan*

Xinjiang Key Laboratory of Biological resources and Genetic Engineering / College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, Xinjiang, China

In order to investigate whether, a pathogenesis-related protein gene from an annual halophytic speciesDrob., was involved in the response to plant defense, qRT-PCR was employed to detect its expression patterns under abscisic acid (ABA), jasmonic acid (JAs), ethylene synthesis direct precursor (ACC), and NaCl treatments. We also identified resistances to salt, drought andtomato (tDC3000) of transgenic tobacco were identified. The expression ofgene in roots was significantly higher than that in shoots, and positively induced by ABA, JAs, ACC, and NaCl treatments. The malondialdehyde (MDA) content of transgenic tobacco was significantly lower than that of wild-type tobacco, showing a strong resistance to drought. The ectopic expression ofgene improved plant growth under salt stress. After infection of, transgenic tobacco leaves showed serious necrosis reaction, but the overall resistance phenotype of the plants was significantly better than that of WT. Subcellular localization analysis showed SfPR1a was localized in the plant cell apoplastic space. The above results indicated that thegene is involved in plant resistance to abiotic and biotic stresses.

pathogenesis-related protein gene; expression pattern; transgenic tobacco; resistance function; subcellular localization

2019-06-04;

2019-12-26;

2020-01-15.

10.3724/SP.J.1006.2020.94082

王艷, E-mail: wangyanxju@126.com

E-mail: hengyouqiang706567@163.com

本研究由新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2017D04026)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31860061)資助。

This study was supported by the Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources Genetic Engineering (2017D04026) and the National Natural Science Foundation of China (31860061).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200115.1140.022.html