申文豪，楊 頌，姜 敏，張 瑋

（泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

雖然肝癌的新增發(fā)病率逐年下降，2019年全世界新增腫瘤發(fā)病率排名中已跌出前十，但其腫瘤死亡病例的占比仍高居第5位[1]。由于地域性經濟的差距，導致各地醫(yī)療水平和人們重視程度不同，很多人在確診時就已處于腫瘤晚期。進行肝癌治療時，患者多采用綜合治療原則，早期應用手術或者肝移植，中晚期應用動脈栓塞、局部消融、放療、化療及生物分子靶向治療等措施。中藥三七提取物三七總皂苷具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡等作用，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)其具有化療增敏和放療增敏的作用，但其作用機制尚不明確[2,3]。本研究以肝癌細胞株HepG2為研究對象，采用基因芯片檢測技術，探討三七總皂苷誘導肝癌細胞HepG2的基因表達譜的變化，篩選差異表達的基因，并進行差異表達基因功能分析，以期為研究三七總皂苷的抗腫瘤機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑三七總皂苷（成都貝斯特試劑有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基（HyClone公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)肝癌HepG2細胞（中國科學院上海細胞庫），培養(yǎng)于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3d～4d傳代一次。取對數增殖期細胞進行實驗，傳代次數＜20次。

1.3 基因芯片200微摩爾/升三七總皂苷處理HepG2細胞，同樣體積的DMSO處理同時細胞作為對照組，48小時后，采用Trizol試劑提取總RNA。由基爾頓生物科技（上海）有限公司采用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit方法進行文庫構建、測序。

1.4 差異表達基因及功能富集分析采用Audic S

算法進行差異表達基因分析，將錯誤發(fā)現(xiàn)率（Falsediscovery rate，F(xiàn)DR）校正后的FDR＜0.05且差異倍數|log2FC|≥1的視為差異表達基因，并對篩選得到的差異表達基因進行聚類分析。利用GO數據庫對差異表達的基因進行GO信號通路富集分析。

2 結果

2.1 轉錄組測序與差異表達基因分析轉錄組測序得到對照組和處理組總的reads數分別有64025270和64179790條，過濾得到clean reads數所占比例分別為96.8%和96.7%，共檢測到58233個基因，有統(tǒng)計學差異表達基因77個，其中上調的基因30個，下調的基因47個，聚類圖（1A）和火山圖（1B）見圖1。

圖1 差異表達基因聚類圖（1A）和火山圖（1B）

2.2 差異表達基因GO分類統(tǒng)計利用GO數據庫（Gene Ontology，http：//www.geneontology.org/），將基因按照它們參與的生物學過程（Biological Process，BP）、構成細胞的組分（Cellular Compo?nent，CC）和實現(xiàn)的分子功能（Molecular Func?tion，MF）進行分類。對差異表達基因進行GO分類統(tǒng)計，并將所得結果繪制上、下調基因GO注釋柱形圖（圖2）。

圖2 差異表達基因GO注釋柱形圖

2.3 差異表達基因GO富集分析利用GO數據庫，對差異表達基因進行GO功能顯著性富集分析，使用軟件：Goatools（https：//github.com/tanghai?bao/GOatools），使用方法為Fisher精確檢驗，為控制計算的假陽性率，使用4種多重檢驗方法（Bon?ferroni，Holm，Sidak和false discovery rate）（West?fall和Stanleyyoung，1989）對P值進行了校正，經過校正的P值≤0.05時，認為此GO功能存在顯著富集情況。見圖3。

圖3 差異表達基因GO富集柱狀圖

2.4 顯著富集GO的層級結構展示通過對GO富集分析產生的GO主題進行可視化分析，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷在多個方面產生影響，主要為分子功能：小分子、核苷酸磷酸化分子，核苷酸分子，黃素腺嘌呤二核苷酸分子；生物過程中的高爾基體功能相關；高爾基體囊泡介導轉運、高爾基體內囊泡循環(huán)逆行轉運、定位高爾基體的蛋白；細胞組分：細胞質等方面存在顯著差異性，見圖4。

圖4 差異表達基因的顯著性GO有向無環(huán)圖

3 討論

本研究共發(fā)現(xiàn)三七總皂苷處理肝癌HepG2細胞后異常表達的基因77個，其中56個基因與GO Term中的41個主題相關，分別是25個上調的基因和31個下調的基因。相關主題占比超過50%的基因有7個，分別為ARPC4-TTLL3、RBM4、MYBPC1、

ATP6V1B1、NUPR1、PLB1、XXbac-BPG32J3.22，它們分別至少同21個主題相關。其中研究較多的與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關的基因為上調基因中的RBM4、下調基因中的NUPR1。

RBM4是RNA結合蛋白，具有抑制腫瘤生長的作用，可以通過調節(jié)靶基因前體mRNA的可變剪接發(fā)揮抑制作用。RBM4通過促進雌激素受體α（ERα）的泛素化降解下調ERα的表達，發(fā)揮抑制乳腺癌的作用[4]。更多資料顯示，RBM4可以抑制肺癌H157細胞、卵巢癌SKOV3細胞、胰腺癌Panc-1細胞、肝癌HepG2細胞及前列腺PC-3細胞的生長[5]。RBM4通過抑制SRSF1的表達，降低致癌基因S6K1和4E-BP1的磷酸化激活，抑制mTOR通路[5]。大量臨床數據顯示，非小細胞肺癌、乳腺癌和胰腺癌的腫瘤組織中表達的RBM4比癌旁正常組織中的低[6-8]。KM plotter數據庫分析RBM4和腫瘤患者生存率之間的關系，發(fā)現(xiàn)RBM4的高表達與肺癌、乳腺癌和卵巢癌總體生存率的上升有相關性，可能是影響腫瘤患者生存率的獨立預后因素[5]。

NUPR1蛋白是一種定位于細胞核的小分子蛋白，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，能夠促進乳腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤的生長[9]。NUPR1蛋白及其mRNA在臨床收取的多種類型的腫瘤標本中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。乳腺良性病變向乳腺癌前病變發(fā)展，最后發(fā)展為乳腺癌，NUPR1在其發(fā)展過程種逐漸增高，且其高表達與預后不良相關[9]。正常肝臟組織中無NUPR1的表達，肝癌的癌前病變，如肝炎和肝硬化中，NUPR1表達逐漸增高，肝癌樣本中表達最高。ZZW-115是一種NUPR1抑制劑，不僅能誘導細胞凋亡和壞死抑制腫瘤細胞生長，而且能誘導線粒體衰竭導致細胞死亡[10]。

我們前期的研究顯示三七總皂苷抑制肝癌細胞的生長，提高其對順鉑和X射線的敏感性[2,3]，可能和三七總皂苷上調RBM4的表達、下調NU?PR1的表達相關。通過本次基因芯片檢測與分析，可以提出假設：三七總皂苷可以通過增加RBM4的表達，抑制mTOR通路，啟動細胞凋亡和壞死機制，抑制NUPR1的表達，通過線粒體衰竭誘導細胞死亡，達到抑制腫瘤細胞生長的作用。

4 結論

肝癌發(fā)生發(fā)展過程涉及多個生物學過程和信號通路的改變。本研究分析了三七總皂苷對肝癌HepG2細胞的基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)差異表達的基因77個，其中上調30個，下調47個。基因功能注釋結果表明三七總皂苷通過改變多個基因的表達，影響與腫瘤密切相關的生物學進程和信號通路。在異常表達的基因中，RBM4和NUPR1是已知的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的基因，可能與三七總皂苷調控肝癌的放療和化療敏感性存在一定的相關性。