黎青華，堵國成*，李江華，劉 松

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

紅曲霉菌——真菌界、子囊菌門、子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科[1]，由法國科學(xué)家Van Tieghem于1884年分類并命名。紅曲紅色素是紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物，是一種用微生物發(fā)酵制備的安全無毒的天然食用色素[2]。隨著生活水平的提高和安全意識的增強(qiáng)，紅曲色素的市場需求量也隨之迅速擴(kuò)大[3-4]。

紅曲紅色素可替代亞硝酸鹽作為肉制品中的著色劑，不僅賦予肉制品鮮艷的光澤，還大大降低了肉制品中致癌物亞硝酸鹽含量[5-6]。紅曲紅色素應(yīng)用在紅曲餅干、紅曲面包、紅曲糕點(diǎn)、紅曲面條等面制品中，不影響產(chǎn)品的口感[6]。紅曲紅色素還可作為調(diào)色劑應(yīng)用于飲料和醫(yī)藥方面等[7]，如紅曲葡萄酒、紅曲飲料等。

目前紅曲紅色素生產(chǎn)有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種方式。鄭虹等[8]以大米與玉米粒為基質(zhì)，紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的色價可達(dá)到1 005.42 U/g。童愛均等[9]利用響應(yīng)面法對固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使紅曲色素色價達(dá)到6 684.16 U/g。由于發(fā)酵周期較長、條件不易控制且容易染菌，固態(tài)發(fā)酵已逐漸失去市場競爭力。液態(tài)發(fā)酵不但工藝上自動化程度高、周期短，而且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、純度高[10-11]。然而，紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲紅色素的能力較低，目前國內(nèi)液態(tài)發(fā)酵的平均色價水平為650 U/mL，這嚴(yán)重制約著液態(tài)發(fā)酵的推廣與應(yīng)用[12-13]。

選育適于液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲紅色素的高產(chǎn)菌株及優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵工藝是提高液態(tài)發(fā)酵色素產(chǎn)量的重要策略[14]。常壓室溫等離子體誘變技術(shù)（ARTP）誘變比傳統(tǒng)物理與化學(xué)誘變技術(shù)更高效、安全、便捷，且誘變所得突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，因而受到廣大研究者的青睞[15]。

作者利用ARTP技術(shù)對紫紅曲霉（Monascus purpureus）LBBE進(jìn)行誘變，獲得了高產(chǎn)菌株，優(yōu)化了高產(chǎn)菌的發(fā)酵條件并驗(yàn)證其在50 L罐中的發(fā)酵性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株紫紅曲霉（Monascus purpureus）LBBE，作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 可溶性淀粉4%，麥芽糖4%，蛋白胨3%，瓊脂粉2%；乳酸調(diào)至pH 5.3。

2）種子培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 秈米粉5%，玉米漿1.2%，NaNO30.2%，酵母膏0.9%，KH2PO40.18%，MgSO4·7H2O 0.09%；乳酸調(diào)至pH 4.5。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 秈米粉12.5%，黃豆粉2.5%，玉米漿0.9%，NaNO30.18%。先加入0.15%～2%的中溫α-淀粉酶升溫至60℃，酶解30 min，再用乳酸調(diào)至pH 3.7。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活化培養(yǎng)從成熟的紅曲平板上挑取幾環(huán)紅曲霉菌于加有玻璃珠的無菌去離子水中，搖勻打散后用脫脂棉過濾制成孢子懸液，稀釋后涂布PDA平板，成熟后挑選直徑較大、顏色較紅的單菌落轉(zhuǎn)接PDA試管斜面，33.5℃培養(yǎng)6～7 d。

1.2.2 常壓室溫等離子體（ARTP）誘變將紅曲霉從試管斜面轉(zhuǎn)接平板，培養(yǎng)成熟后用無菌水刮取洗滌紅曲霉平板，利用脫脂棉過濾后獲得孢子懸液。然后用無菌去離子水洗滌2～3次，去掉溶解的色素，懸浮備用。取制好的孢子懸液，血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)整至合適濃度（107個/mL，體積分?jǐn)?shù)15%甘油），取10μL孢子懸液均勻涂于載片上進(jìn)行誘變。誘變條件設(shè)為：通氣量10 SLM、功率80 W、時間分別為0、10、20、30、40、50、60 s。誘變結(jié)束后，將載片浸于500μL的無菌水中振蕩洗脫，稀釋10倍、100倍、1 000倍后分別取50μL懸液涂布PDA平板，0 s計數(shù)為B，其他計數(shù)為A。

其中，A為誘變后存活孢子數(shù)；B為誘變前總孢子數(shù)。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵挑取2～3環(huán)紅曲霉菌菌絲體接種到種子培養(yǎng)基中（50 mL/500 mL），33.5℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。然后按8%的接種體積分?jǐn)?shù)將種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基（60 mL/500 mL），33.5℃、220 r/min發(fā)酵培養(yǎng)6 d，挑選紅曲紅色價高的菌株并統(tǒng)計正向突變率。

1.2.4 傳代穩(wěn)定性驗(yàn)證對挑選出來的高產(chǎn)菌株進(jìn)行試管斜面?zhèn)鞔?，培養(yǎng)成熟后再次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測紅曲色素色價，循環(huán)傳代5次，驗(yàn)證傳代穩(wěn)定性。

1.2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1）接種體積分?jǐn)?shù)優(yōu)化 將培養(yǎng)成熟的種子液分別按5%、6%、7%、8%、9%、10%等6個不同的接種體積分?jǐn)?shù)接種到發(fā)酵液中，33.5℃、220 r/min培養(yǎng)6 d，以紅曲紅色價為指標(biāo)，考察接種體積分?jǐn)?shù)對色素積累的影響。

2）發(fā)酵的初始pH優(yōu)化 分別選取3.5、3.7、3.9、4.1、4.3、4.5為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值，考察色素積累情況。

3）金屬離子的優(yōu)化 在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加1 g/L的CaCl2、MnSO4、FeSO4、ZnSO4，以紅曲紅色價為指標(biāo)探究各金屬離子的影響。

1.2.6 50 L罐發(fā)酵

1）搖瓶種子培養(yǎng) 向長有成熟紅曲霉的茄子瓶中加入30 mL無菌水刮取洗滌孢子，脫脂棉過濾后獲得孢子懸液。取5 mL孢子懸液接種于裝液600 mL種子培養(yǎng)基的3 L搖瓶中，33.5℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

2）二級種子罐培養(yǎng) 將600 mL搖瓶種子全部接入裝液量70%的10 L種子罐，0.75 vvm、300 r/min培養(yǎng)20 h。

3）50 L罐分批發(fā)酵：按7%的接種體積分?jǐn)?shù)將二級種子罐接入裝液量70%的50 L發(fā)酵罐，33.5℃培養(yǎng)96 h。期間根據(jù)菌絲的生長狀態(tài)適當(dāng)調(diào)整通氣量和轉(zhuǎn)速。接種后，調(diào)整通氣量和轉(zhuǎn)速分別為0.25 vvm和300 r/min；接種6 h后調(diào)至0.38 vvm和350 r/min；接種24 h調(diào)至0.75 vvm和350 r/min，第37.5小時調(diào)至0.75 vvm和400 r/min至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.7 色價檢測用移液管準(zhǔn)確吸取10 mL發(fā)酵液于100 mL容量瓶中，然后加入90 mL體積分?jǐn)?shù)70%的酒精，搖勻后靜置30 min，離心后取上清液，用體積分?jǐn)?shù)70%酒精稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)于1 cm比色皿中，用分光光度計檢測波長為505 nm處的吸光度（A）。

色價（U/mL）=A×總稀釋倍數(shù)

1.2.8 單糖測定斐林試劑法測定還原糖質(zhì)量濃度。

1.2.9 總糖測定取10 mL發(fā)酵液，加入5 mL水和5 mL體積分?jǐn)?shù)50%硫酸溶液，煮沸5 min，然后用斐林試劑法測定還原糖質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變致死率優(yōu)化

ARTP即常壓室溫等離子體，能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25～40℃之間的、具有高活性粒子濃度的等離子體射流，等離子體會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。但也有少數(shù)細(xì)胞會通過自身的修復(fù)存活下來，同時會帶來突變。采用ARTP對紅曲紅孢子懸液進(jìn)行誘變，控制誘變時間為惟一變量，通過孢子萌發(fā)計數(shù)的方法，得出的致死率與誘變時間的關(guān)系。隨機(jī)挑取一定數(shù)量的單菌落發(fā)酵，統(tǒng)計色價情況，獲得正突變率與致死率的變化情況，見圖1。隨著誘變時間的延長，孢子的致死率越來越高，30 s致死率達(dá)到85%以上。正突變率整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，30 s和40 s的正突變率分別為45.2%和44.6%，相差不大，而因?yàn)楦咧滤缆视欣诳s小突變庫，故誘變條件確定為：通氣量10 SLM、功率80 W、時間40 s，此時保證高正突變率的情況下，致死率達(dá)到了95%。

圖1 ARTP誘變的正突變率與致死率關(guān)系Fig.1 Relationship between positive mutation rate and lethality rate of ARTP mutagenesis

2.2 多輪迭代誘變對紅曲色素發(fā)酵的影響

在致死率為95%的條件下對紅曲孢子懸液進(jìn)行誘變，涂板后獲得單菌落。為了盡可能挑選高產(chǎn)菌株，觀察并比較單菌落與色圈的直徑比，比值越小越好，同時觀察色圈顏色的深淺，越深越好。將挑選的突變株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，挑選色價最高的菌株傳代并作為下一輪誘變的出發(fā)菌株。如圖2，在第一次誘變時，出發(fā)菌株對誘變條件非常敏感，正突變率高達(dá)44.6%，隨著誘變次數(shù)的增加，正突變率明顯下降。在經(jīng)過10輪誘變篩選后，突變株LBBE-15最高色價達(dá)到1 244 U/mL，相比最初出發(fā)菌株提高了1.26倍，而正突變率由最初的44.6%降到3.8%。可能是隨著誘變次數(shù)的增加，菌株對誘變條件產(chǎn)生了一定的“疲勞效應(yīng)”[16]。

圖2 誘變次數(shù)對色價及正向突變率的影響Fig.2 Effects of mutagenesis on color value and forward mutation rate

2.3 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性分析

經(jīng)過10輪誘變，獲得的紅曲紅色素高產(chǎn)突變株LBBE-15形態(tài)也發(fā)生了較大的變化，見圖3。菌絲變得纖長粗壯，交錯更加緊密。在深層發(fā)酵中，可以將菌絲體的生長狀態(tài)分為活性生長區(qū)域、非活性生長區(qū)域、小空泡區(qū)、衰退區(qū)域與自溶區(qū)，次級代謝產(chǎn)物通常與菌絲體的非活性生長部位有關(guān)[20]。纖長的菌絲具有更長的非活性生長區(qū)域，有利于積累更多的紅曲色素。對突變株進(jìn)行5次連續(xù)傳代，并且每一代都進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，以紅曲紅色價為指標(biāo)，考察其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。在相同的培養(yǎng)條件下，各代間色價的波動范圍很小，說明突變株的遺傳穩(wěn)定性很好。

圖3 紅曲霉單菌落Fig.3 Single colony of Monascus

圖4 突變株遺傳穩(wěn)定性分析Fig.4 Genetic stability analysis of mutant strain

2.4 培養(yǎng)條件對紅曲發(fā)酵的影響

基于種群的數(shù)量平衡原理[17]，搖瓶發(fā)酵時，種子液的接種體積分?jǐn)?shù)直接決定了其種群的數(shù)量。接種體積分?jǐn)?shù)太低，菌絲生長緩慢，會延長發(fā)酵周期，降低發(fā)酵效率。接種體積分?jǐn)?shù)太高，菌絲生長太快，營養(yǎng)物質(zhì)過快被消耗，不利于色素積累。合適的接種體積分?jǐn)?shù)有利于縮短發(fā)酵周期，同時也會對紅曲色素的積累帶來較大影響[10]。如圖5所示，相同條件下，接種體積分?jǐn)?shù)為7%時色價最高。

圖5 接種體積分?jǐn)?shù)對色價的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on color value

紅曲霉是一種嗜酸菌，尤嗜乳酸，生長的最適pH為3.5～5。培養(yǎng)基的pH值會影響微生物的生理特性[18]。細(xì)胞膜上的電荷情況會受pH的變化而變化，一方面會影響細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，另一方面會影響色素的分泌。因此，確定好紅曲霉生長繁殖的最初pH值是提高色價的關(guān)鍵因素之一。如圖6所示，pH為3.7時，發(fā)酵效果最好。

圖6 pH值對色價的影響Fig.6 Effect of pH on color value

根據(jù)微生物生長的特性，通過優(yōu)化培養(yǎng)基的組成，如碳源、氮源、金屬離子的濃度及種類，控制絲狀真菌形態(tài)[19]。有報道證明Ca2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等離子都與菌絲體合成有關(guān)[20-21]。試驗(yàn)選取不同金屬離子，考察其對紅色素合成的影響，結(jié)果見圖7。錳離子和亞鐵離子對色素的積累有促進(jìn)作用，鈣離子和鋅離子的存在不利于紅曲色素的積累。

圖7 金屬離子對色價的影響Fig.7 Influence of metal ions on color value

2.5 50 L罐發(fā)酵

50 L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，為了研究溶氧條件對色素積累的影響，恒定轉(zhuǎn)速為400 r/min，控制通氣量分別為0.5、1.0、1.5 vvm進(jìn)行分批發(fā)酵，同時對色價和菌絲體的形態(tài)進(jìn)行監(jiān)控，菌絲形態(tài)見圖8。

圖8 發(fā)酵過程中的菌絲狀態(tài)Fig.8 Morphology of mycelium during fermentation

試驗(yàn)結(jié)果表明，溶氧的不同會直接影響菌絲體的形態(tài)，從而影響色素的積累。0.5 vvm溶氧條件下，菌絲生長緩慢，菌絲球松散稀疏，主要呈球狀菌絲體，色素積累緩慢，發(fā)酵周期延長；1.0 vvm溶氧條件下，菌絲生長迅速，菌絲纖長粗壯。進(jìn)入穩(wěn)定期后菌絲相對致密，主要呈簇狀菌絲體，此時色素大量積累；1.5 vvm溶氧條件下，菌絲生長迅猛，菌絲交錯致密，呈緊密簇狀菌絲體，發(fā)酵液粘度增加，發(fā)酵體系溶氧不均，在線溶氧波動很大。隨后發(fā)酵液中出現(xiàn)大量分生孢子，原料消耗很快，發(fā)酵周期縮短，色素積累很少。

將高產(chǎn)突變菌株LBBE-15進(jìn)行50 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵試驗(yàn)，控制通氣量為1.0 vvm，手動調(diào)整轉(zhuǎn)速使溶氧在20%左右。發(fā)酵過程中對pH、單糖、總糖及色價進(jìn)行檢測，每12小時取一次樣，結(jié)果見圖9。隨著菌絲的生長，發(fā)酵液的pH緩慢上升。在前24 h，菌絲呈對數(shù)生長，溶氧迅速下降。菌絲分泌的淀粉酶對米粉進(jìn)行酶解使得單糖質(zhì)量濃度升高，但沒有色素積累。24 h后菌絲繼續(xù)生長，糖不斷被消耗，并開始積累色素。到96 h糖基本耗完，發(fā)酵結(jié)束，最終獲得色價為642 U/mL。

圖9 突變株LBBE-15 50 L罐發(fā)酵曲線Fig.9 Fermentation curve of 50 L jar-fermenter of mutant strain LBBE-15

從發(fā)酵結(jié)果看，發(fā)酵罐中的色價水平只有搖瓶的一半，對比分析搖瓶和發(fā)酵罐的發(fā)酵液發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐中菌絲生長不好，菌絲量明顯低于搖瓶，分析主要原因是發(fā)酵培養(yǎng)基本身太粘稠造成溶氧總體上處于偏低的水平。而單方面增加通氣量和轉(zhuǎn)速會短時間增加發(fā)酵體系的溶氧，但菌絲的迅速生長會增加體系的粘稠度造成溶氧不均，且加大轉(zhuǎn)速帶來的剪切力會打斷菌絲。這也解釋了在通氣量為1.5 vvm時的分批發(fā)酵失敗的原因，同時也說明發(fā)酵工藝還有很大的改善空間。后續(xù)會著重對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及比例進(jìn)一步調(diào)整和優(yōu)化，在保證正常溶氧的基礎(chǔ)上再進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。

3 結(jié)語

為提高紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素能力，加快紅曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素工業(yè)化進(jìn)程。經(jīng)過10輪的ARTP誘變和篩選，獲得的突變菌株LBBE-15最高色價可達(dá)1 244 U/mL，傳代穩(wěn)定后經(jīng)簡單的培養(yǎng)條件優(yōu)化，搖瓶色價可達(dá)到1 376 U/mL，較出發(fā)菌株色素生產(chǎn)能力有較大提高。在此基礎(chǔ)上，嘗試對突變株LBBE-15進(jìn)行了50 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵試驗(yàn)，通過對轉(zhuǎn)速和通氣量的控制，發(fā)酵96 h可使色價達(dá)到642 U/mL，為后續(xù)菌株的放大培養(yǎng)提供參考。

相對于常規(guī)的誘變技術(shù)，ARTP誘變更加高效、安全、便于操作，且能有效對紅曲霉菌進(jìn)行誘變，獲得高產(chǎn)菌株[15，22]。但實(shí)驗(yàn)中隨著誘變次數(shù)的增加，菌株表現(xiàn)出了一定的“疲勞效應(yīng)”，導(dǎo)致正突變率不斷降低[16]。因此，多種方式的交叉誘變可減少“疲勞效應(yīng)”的影響，誘變效果會更好。

在絲狀真菌液態(tài)深層發(fā)酵中，溶氧是一個關(guān)鍵性問題，溶氧的好壞會直接影響菌絲生長的狀態(tài)，而菌絲的生長形態(tài)直接影響色價的高低。需要注意的是，在絲狀真菌液態(tài)深層發(fā)酵時，絲狀真菌生長成菌絲球，會使培養(yǎng)基變得粘稠，不利于溶質(zhì)傳氧[23]。為了保證溶氧，需要提高轉(zhuǎn)速并增加通氣量，但增大的剪切力會打斷菌絲體，不利于色素的積累。因此，如何控制轉(zhuǎn)速和通氣量是保證所需溶氧的情況下有效提高液態(tài)發(fā)酵色價的關(guān)鍵。