孟 雪，張苗苗，于江珊，施 江，熊雨婕，張澤宇，薛建平①

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北235000）

0 引言

王棗子（Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan）系唇形科香茶菜屬多年生草本植物，多生于山坡背陰處，是香茶菜屬少有的藥食兩用植物［1］. 作為皖北地區(qū)的特色中草藥，“宿州王棗子”已被成功注冊為當(dāng)?shù)氐乩順?biāo)志產(chǎn)品. 在民間經(jīng)過簡單煎煮后即可有效治療肺結(jié)核、肺炎、咽炎等疾?。?］. 王棗子種子一般在當(dāng)年11月到次年2月為休眠期. 通常種子休眠難以萌發(fā)，進(jìn)而限制以種子為材料的相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)展.種子休眠主要包括胚休眠、種皮休眠、綜合休眠［3］. 目前種子休眠解除的方法主要分為物理（干燥后熟、層級作用、變溫處理和超聲處理［4-10］）和化學(xué)（激素處理和氧化劑處理［11-12］）處理方法. 鄭相穆等［10］研究表明先高溫再低溫處理可以解除鳳丹種子的休眠，而楊榮超等［12］認(rèn)為植物激素在種子休眠與萌發(fā)中起到至關(guān)重要的調(diào)控作用. 目前關(guān)于打破王棗子種子休眠的方法尚未見報道.

本課題組前期研究中，開展王棗子組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)愈傷組織褐化是植株再生的主要限制因子. 為此，我們以種子萌發(fā)幼苗的嫩葉與成熟植株的嫩葉為外植體進(jìn)行對比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二者在愈傷組織誘導(dǎo)方面無差異，愈傷誘導(dǎo)率均大于90%，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后成熟植株嫩葉誘導(dǎo)的愈傷組織很快褐化死亡（即便添加多種防褐化物質(zhì)），而幼苗嫩葉來源的愈傷褐化程度極為輕微，且能高效再生為完整植株［13］，表明種子萌發(fā)幼苗的嫩葉是王棗子組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的良好材料. 然而，在開展種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)過程中，種子處于休眠狀態(tài)，嚴(yán)重影響王棗子的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究.

本研究以當(dāng)年收獲的王棗子種子為試驗(yàn)材料，采用單因素試驗(yàn)法對限制種子萌發(fā)的條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得打破種子休眠期的合適條件，為該植物的組織培養(yǎng)研究提供外植體材料.

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自安徽省宿州市夾溝（117°06′E、33°89′N），野生王棗子植株經(jīng)薛建平教授鑒定為Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan，待種子成熟后于2017年10月收獲用于試驗(yàn).

1.2 方法

1.2.1 種子消毒及萌發(fā)

采用鹽水密度差異法篩選圓潤飽滿的種子，晾干后用于相應(yīng)處理，之后進(jìn)行表面消毒. 70%乙醇浸泡30 s后用25%次氯酸鈉（有效氯2%）浸泡10 min，無菌水潤洗5次. 吸干種子表面水分接種在MS基本培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH 5.8），25 ℃黑暗培養(yǎng). 各處理3皿，每皿50粒種子. 7 d后開始間隔1 d統(tǒng)計王棗子種子的情況，21 d后測定芽長. 以第21 d的萌發(fā)結(jié)果計算最終發(fā)芽率.

發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)）×100%.

1.2.2 低溫處理將種子放入4 ℃冰箱內(nèi)冷藏7、14、21、28 d后，置于水中浸泡6 h，按上述方法進(jìn)行表面消毒，吸干表面水分后均勻鋪灑在MS基本培養(yǎng)基里. 以未進(jìn)行低溫處理的種子為對照.

1.2.3 GA3浸泡將種子置于50、100 和150 mg/L GA3浸泡6 h 和24 h 后進(jìn)行表面消毒，吸干表面水分后均勻鋪灑在MS基本培養(yǎng)基里. 分別以無菌水浸泡6 h和24 h的種子為對照.

1.2.4 超聲處理將種子超聲處理3、5和7 min，然后用無菌水浸泡6 h，接著進(jìn)行表面消毒，吸干表面水分后均勻鋪灑于MS基本培養(yǎng)基里. 以未進(jìn)行超聲處理的種子為對照.

1.2.5 綜合處理以經(jīng)單因素試驗(yàn)篩選出的參數(shù)進(jìn)行4 種組合處理（低溫+GA3、低溫+超聲、GA3+超聲、低溫+GA3+超聲），表面消毒后吸干表面水分，均勻鋪灑在MS基本培養(yǎng)基里，以無菌水浸泡6 h的種子為對照.

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以3次實(shí)驗(yàn)的平均值表示. 運(yùn)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對種子萌發(fā)的影響

低溫處理對王棗子種子萌發(fā)有一定促進(jìn)作用（表1）. 對照組中種子不能萌發(fā)，而3個低溫處理組中種子萌發(fā)率均在2.5%～3.3%之間，以處理14 d萌發(fā)率較高，達(dá)到3.26%. 培養(yǎng)3周后，萌發(fā)種子的芽長無明顯差異. 說明試驗(yàn)所設(shè)低溫處理可一定程度打破種子休眠，但作用有限. 因此，選擇萌發(fā)率較高的4 ℃低溫14 d處理用于后續(xù)試驗(yàn).

表1 不同低溫處理時長下王棗子種子萌發(fā)結(jié)果

2.2 赤霉素處理對種子萌發(fā)的影響

如表2所示，4個GA3處理組中王棗子萌發(fā)率均在4.5%～6.1%之間，而對照組在3周后仍然無種子萌發(fā). 所有GA3處理組中，萌發(fā)種子芽長介于1.3～1.8 cm之間. 說明GA3處理能使王棗子種子萌發(fā)，且促進(jìn)芽伸長. 考慮到浸泡時間和GA3濃度，選擇50 mg/L GA3浸泡6 h用于后續(xù)試驗(yàn).

表2 不同赤霉素處理時長下王棗子種子萌發(fā)結(jié)果

2.3 超聲波處理對種子萌發(fā)的影響

如表3所示，超聲波處理能顯著提高王棗子種子萌發(fā)率. 在超聲波處理3 min、5 min、7 min實(shí)驗(yàn)組中萌發(fā)率分別為14.4%、32.3%和23.7%，呈現(xiàn)出倒“V”字型變化趨勢. 表明超聲處理5 min所獲萌發(fā)率最高，處理時間過長或過短都會對種子萌發(fā)有一定抑制.

表3 不同超聲波處理時長下王棗子種子萌發(fā)結(jié)果

2.4 綜合處理對種子萌發(fā)的影響

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以4 ℃低溫處理14 d、50 mg/L GA3浸泡6 h、超聲處理5 min這3個參數(shù)進(jìn)行配對綜合，探討綜合處理對王棗子種子萌發(fā)的影響. 如表4所示，低溫、GA3和超聲3種處理間存在累積效應(yīng)，兩兩組合的萌發(fā)率高于單一處理，以三因素配合處理組萌發(fā)率最高，達(dá)到37.6%（圖1）. 芽長與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，添加GA3的處理顯著促進(jìn)芽伸長. 綜合考慮，4 ℃低溫處理種子2周后用于GA3和超聲處理能有效打破王棗子種子休眠，實(shí)現(xiàn)休眠期種子的萌發(fā).

表4 休眠期王棗子種子萌發(fā)條件優(yōu)化結(jié)果

注 A未處理對照；B超聲處理3 min；C低溫+GA3+超聲處理組. 照片為培養(yǎng)21 d后拍攝

2.5 不同處理對種子萌發(fā)進(jìn)程的影響

由于在實(shí)驗(yàn)中觀察到低溫、GA3和超聲3種處理在促進(jìn)種子萌發(fā)中的疊加效應(yīng)，本研究進(jìn)一步分析3種處理對種子萌發(fā)進(jìn)程的影響. 如圖2所示，GA3和超聲處理組種子在第7 d開始萌發(fā)，而在第9 d才觀察到低溫處理組種子萌發(fā). 3個處理組種子萌發(fā)率在萌發(fā)實(shí)驗(yàn)周期（3周）內(nèi)呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，其中超聲處理組在第19 d仍然還有部分種子萌發(fā).

圖2 不同處理下王棗子種子萌發(fā)進(jìn)程分析

3 討論

種子休眠是植物在長期進(jìn)化中形成的主動應(yīng)對不良環(huán)境的特性［14］，即使在休眠期間各種條件適宜種子也不能萌發(fā)，但施以適當(dāng)?shù)耐獠看碳t可能打破其休眠，恢復(fù)萌發(fā)能力. 然而，不同種子休眠的原因和程度極為復(fù)雜，據(jù)此將休眠類型劃分為生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和綜合休眠等5大類［15-16］.

王棗子種子在采收后不能萌發(fā)，且休眠期持續(xù)整個冬季，嚴(yán)重限制此時期種子相關(guān)實(shí)驗(yàn)的開展. 本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合綜合處理方法，探究適于休眠期王棗子種子萌發(fā)的條件. 結(jié)果表明，4 ℃低溫處理、GA3浸泡和超聲處理都對打破王棗子種子休眠有一定作用，以超聲處理效果最佳. 低溫和GA3處理都是破除植物種子休眠的常用方法，二者都是基于理化環(huán)境改變內(nèi)源相關(guān)激素分布，進(jìn)而解除種子休眠［17-18］. 本研究采用4 ℃低溫處理14 d和50 mg/L GA3浸泡均一定程度打破王棗子種子休眠，但萌發(fā)率僅在2.5%～6.1%之間. 超聲處理能對種子細(xì)胞施以巨大的能量刺激，加速種子內(nèi)部生理生化進(jìn)程，破除種子休眠，提高發(fā)芽率［19］. 本研究采用超聲處理5 min，則將種子萌發(fā)率提高到30%以上，表明堅(jiān)硬的種皮是抑制種子萌發(fā)的重要因素之一. 統(tǒng)計萌發(fā)種子芽長發(fā)現(xiàn)，采用GA3浸泡的種子萌發(fā)后芽長大于未添加GA3的對照組. 3種因素對促進(jìn)王棗子種子萌發(fā)存在累積效應(yīng)，基于各單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的3種條件綜合處理，將休眠期種子萌發(fā)率提高至37.6%. 跟蹤單因素實(shí)驗(yàn)中種子萌發(fā)進(jìn)程表明，超聲處理的種子在萌發(fā)實(shí)驗(yàn)第19 d還有部分種子發(fā)芽，而低溫和GA3處理的種子則在2周后萌發(fā)數(shù)不再增加，說明超聲處理能拓展種子萌發(fā)時間，使得更多種子得以發(fā)芽，提高發(fā)芽率.

香茶菜屬植物種子在萌發(fā)和休眠特性方面存在較大差異. 梁子寧等［20］、閆志剛等［21］研究三葉香茶菜種子的萌發(fā)條件，未報道其休眠現(xiàn)象. 與王棗子類似，葉景學(xué)等［22］則發(fā)現(xiàn)尾葉香茶菜種子在采后經(jīng)歷一個74～104 d的休眠期，但所報道GA3能高效破除尾葉香茶菜種子休眠功能，而對王棗子種子作用有限.

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合綜合處理的方法，獲得休眠期王棗子種子萌發(fā)的最適參數(shù)，以4 ℃低溫處理14 d、50 mg/L GA3浸泡6 h、超聲處理5 min能將王棗子種子萌發(fā)率提高至37.6%，有效破除王棗子種子休眠，為休眠期開展該藥用植物種子質(zhì)量檢測或萌發(fā)分析奠定基礎(chǔ).