左右，趙慶鎖，羅史科，杜娟

蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）指的是多種原因引發(fā)的血液進入蛛網(wǎng)膜下腔導致的綜合征，其發(fā)病率較高，病情進展快，致殘率和致死率均較高［1-2］。了解SAH發(fā)病機制，從而對SAH進行有效的防治十分重要。血腦屏障損傷是SAH腦損傷的重要環(huán)節(jié)［3］。已有實驗證明，p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）信號通路在SAH后腦損傷中具有重要作用［4］。而基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）與腦血管內(nèi)皮細胞死亡和腦損傷密切相關(guān)［5］。已有研究表明通過p38 MAPK 信號轉(zhuǎn)導通路作用可調(diào)節(jié)MMP-9 表達［6］。且有關(guān)于冠狀動脈粥樣硬化的研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可通過激活巨噬細胞和促進炎癥反應導致MMP-9 表達的升高［7］。但是，關(guān)于SAH 時是否存在AngⅡ通過激活p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路進一步介導MMP-9的表達調(diào)控在國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究于2017年8 月至2018 年6 月從信號轉(zhuǎn)導途徑探討SAH 時MMP-9的表達及作用機制，旨在確定AngⅡ、MMP-9在SAH 發(fā)病中的作用以及機制，從而為自AngⅡ、MMP-9干預途徑防治SAH提供依據(jù)，提高SAH治療水平，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦微血管內(nèi)皮細胞（HBMEC）株（批號1000）均購于上海中喬新舟生物科技有限公司，常規(guī)培養(yǎng)于含10%的新生牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含100 U/mL 的青霉素和鏈霉素，細胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5%二氧化碳，每天以0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行細胞株的傳代培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑和儀器 培養(yǎng)基（批號LM-R1639）均購于上海博升生物科技有限公司，胰蛋白酶（批號T106942）、青霉素（批號106339）、鏈霉素（批號180615-2）購于東恒華道生物科技有限責任公司，96孔板（型號TCP011096）購于廣州潔特生物過濾股份有限公司，微量移液器（型號3120000240）購于德國艾本德股份公司，離心機（型號BJ005267）購于德國艾本德股份公司，醫(yī)用恒溫恒濕培養(yǎng)箱（型號BB15）購于德國Heraeus公司，AngⅡ來源于中國藥品生物制劑檢所，SB203580 p38 MAPK 抑制劑（批號PF-2341066）購于Adooq Bioscience公司，酶聯(lián)免疫分析儀（型號ELISA STARlet）購于默飛世爾科技（中國）有限公司，MMP-9 Elisa 試劑盒（型號JPinChem48T/96T）購于今品化學技術(shù)（上海）有限公司，T100 PCR儀（型號1861096）購于美國伯樂公司，RNA提取試劑盒（型號R0028）購于碧云天公司，PCR引物購于大連寶生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（型號A3500）購于美國Promega 公司，實時定量PCR 試劑盒（型號DRR096A）和SYBR Premix EX Ta（型號DRR041A）購于日本Takara公司，電泳儀（型號DYCZ-28）購于北京市六一儀器廠，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）為自配，顯微鏡（型號13TS100）購于日本Nikon公司。

1.2.2 實驗分組 HBMEC 細胞株分為AngⅡ組、AngⅡ+SB203580 組和對照組。各組細胞接種于96孔板，細胞懸液濃度為4×103個/孔，細胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5%二氧化碳，待細胞生長至60%～70%密度時進行處理。

1.2.3 實驗處理 其中AngⅡ組以AngⅡ處理，使其最終濃度為100 μg/L，90 min、2 h、4 h、6 h、12 h后取細胞上清液進行相關(guān)指標檢測；AngⅡ+SB203580組以5 μM 的SB203580 處理20 min 后，以AngⅡ處理，使其最終濃度為100 μg/L，90 min、2 h、4 h、6 h、12 h 后取細胞上清液進行相關(guān)指標檢測；對照組加入與AngⅡ組等體積的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)90 min、2 h、4 h、6 h、12 h 后取細胞上清液進行相關(guān)指標檢測。各組均重復3次。

1.3 觀察指標和檢測方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組細胞上清液MMP-9水平 檢測時間為處理90 min、2 h、4 h、6 h、12 h，將獲取的細胞液以3 500 r/min轉(zhuǎn)速、3 cm離心半徑進行離心5 min，待分層后取細胞上清液進行相關(guān)指標的檢測，具體檢測操作嚴格按照酶標儀以及相關(guān)試劑盒的說明書進行，由同意ELISA 相關(guān)檢測經(jīng)驗豐富者進行檢測操作。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測各組細胞p38 MAPK的mRNA表達水平 檢測時間為處理90 min、2 h、4 h、6 h、12 h，常規(guī)獲取細胞，提取總RNA，以cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以人β-肌動蛋白（β-actin）基因為內(nèi)參，各引物序列為β-actin：正向：5′-GGCACCCAGCACAATGAAGATCAA-3′；反向：5′-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCTGA-3′。p38 MAPK：正向：5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′；反向：5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′。PCR 反應條件為：95 ℃預變性15 s、95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s，共進行45 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算p38 MAPK的mRNA相對表達量。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞p38 MAPK的蛋白表達水平 檢測時間為處理12 h。離心收集細胞，PBS 洗滌2 次，添加封閉液體稀釋p38 MAPK 一抗（1∶1 000）2 mL，室溫孵育120 min，PBS洗滌2次。添加封閉液體稀釋二抗（1∶5 000）3 mL，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次。將膜片進行電化學試劑盒發(fā)光，常規(guī)進行膠片的曝光、顯影以及定影，通過凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描和分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 三組細胞上清液MMP-9水平比較 與對照組比較，AngⅡ組各時間段的細胞上清液MMP-9 水平升高，AngⅡ+SB203580 組各時間段的細胞上清液MMP-9 水平降低（P＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+SB203580 組各時間段的細胞上清液MMP-9 水平降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 三組細胞p38 MAPK 的mRNA 表達水平比較 與對照組比較，AngⅡ組細胞p38 MAPK各時間段的mRNA表達水平升高，AngⅡ+SB203580組細胞各時間段的p38 MAPK的mRNA表達水平降低（P＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+SB203580組各時間段的細胞p38 MAPK 的mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 三組細胞p38 MAPK 的蛋白表達水平比較以p38 MAPK條帶灰度與β-actin條帶灰度的比值為p38 MAPK 的蛋白表達水平，對照組、AngⅡ組、AngⅡ+SB203580 組p38 MAPK 的蛋白表達水平分別為（0.635±0.133）、（0.452±0.105）和（0.276±0.081），三組p38 MAPK的蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（F＝18.762，P＜0.001）。

與對照組比較，AngⅡ組細胞處理12 h p38 MAPK 的蛋白表達水平升高（P＜0.001），AngⅡ+SB203580 組處理12 h 細胞p38 MAPK 的蛋白表達水平降低（P＜0.001）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+SB203580組處理12 h細胞p38 MAPK的蛋白表達水平降低（P＜0.001）。見圖1。

圖1 三組細胞p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的蛋白表達

3 討論

SAH 是臨床常見重病癥，其發(fā)病急，無明顯誘因，其病人年齡相對較輕，是嚴重危害人類健康病癥［8-9］。SAH的發(fā)生發(fā)展涉及多個病理過程及相關(guān)基因，其中炎癥反應在SAH中的作用已得到多個研究認可［10］。多種腦細胞均可合成分泌MMP-9，MMP-9為與炎癥反應密切相關(guān)因子，已有多個研究證實SAH的MMP-9水平異常升高，MMP-9參與SAH的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用［11-12］。

表1 三組細胞上清液各處理時間段基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）水平比較/（μg/L，）

表1 三組細胞上清液各處理時間段基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）水平比較/（μg/L，）

注：AngⅡ為血管緊張素Ⅱ，SB203580示SB203580 p38 MAPK抑制劑。各組均重復3次。與對照組比較，aP＜0.01；與AngⅡ組比較，bP＜0.001

表2 三組細胞各處理時間段p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的mRNA表達水平比較/

表2 三組細胞各處理時間段p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的mRNA表達水平比較/

注：AngⅡ為血管緊張素Ⅱ，SB203580示SB203580 p38 MAPK抑制劑。各組均重復3次。與對照組比較，aP＜0.05；與AngⅡ組比較，bP＜0.001

隨著關(guān)于SAH 研究的深入，其血腦屏障損傷、腦損傷的危害關(guān)注較多，而腦損傷的發(fā)生不但與炎癥反應相關(guān)，亦涉及血管的病變、細胞死亡等［13］。血管內(nèi)皮細胞可通過分泌舒血管物質(zhì)和縮血管物質(zhì)以維持腦血管的正常功能狀況，SAH 發(fā)生后，病人的腦血管內(nèi)皮細胞發(fā)生改變，可導致血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生，從而導致舒血管物質(zhì)水平的降低以及縮血管物質(zhì)分泌的增加［14］。AngⅡ為縮血管物質(zhì)，廣泛分布在整個神經(jīng)系統(tǒng)，有AT1R 和AT2R 兩個亞型，已有研究表明在SAH發(fā)生后AT1R和AT2R表達的異常，這說明，AngⅡ與SAH的發(fā)生發(fā)展亦可能密切相關(guān)［15］。而腹主動脈瘤中，AngⅡ可影響炎癥反應從而導致MMP-9 合成分泌的增加［16］。然而目前關(guān)于在SAH 病人中AngⅡ是否可通過影響MMP-9表達增加而影響病情發(fā)展研究甚少。多種應激、前炎癥細胞因子與生長因子均可激活p38 MAPK，且有研究表明，SAH后炎癥反應及血腦屏障損傷均可伴隨p38 MAPK 信號通路表達的異常，其在SAH 后早期腦損傷中具有重要作用［17］。是否在SAH時AngⅡ通過激活p38 MAPK 信號轉(zhuǎn)導通路，進一步介導MMP-9 的表達調(diào)控而影響病情發(fā)展研究甚少。

于沛霞等［18］的研究表明p38 MAPK/MMP-9 通路活性變化與新生大鼠腦缺氧缺血損傷密切相關(guān)。因此，本研究從p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑為切入點，探討SAH 時AngⅡ、p38 MAPK/MMP-9 通路對SAH的影響及其可能機制。本研究結(jié)果顯示，添加AngⅡ可上調(diào)HBMEC細胞株細胞上清液MMP-9水平和細胞p38 MAPK 的mRNA 和蛋白表達水平，而同時添加AngⅡ和SB203580 p38 MAPK抑制劑則可導致HBMEC 細胞株細胞上清液MMP-9 水平和細胞p38 MAPK 的mRNA 和蛋白表達水平的降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。提示AngⅡ可能通過激活p38 MAPK 信號通路而提高MMP-9 表達，影響SAH疾病病程。

綜上所述，AngⅡ調(diào)控MMP-9 表達的特點為（1）AngⅡ可上調(diào)MMP-9在HBMEC細胞株細胞上清液中的表達水平；（2）AngⅡ可上調(diào)MMP-9 在HBMEC細胞株細胞中的轉(zhuǎn)錄層面的表達水平；（3）AngⅡ可上調(diào)MMP-9在HBMEC細胞株細胞中蛋白層面的表達水平；（4）AngⅡ可能通過激活p38 MAPK 信號通路上調(diào)MMP-9 表達；（5）AngⅡ上調(diào)MMP-9 表達可促進SAH 發(fā)生發(fā)展。因此，AngⅡ調(diào)控MMP-9表達的意義為（1）抑制AngⅡ可能為SAH 防治途徑之一；（2）p38 MAPK 信號通路干預可能通過抑制AngⅡ?qū)MP-9的調(diào)控作用控制SAH發(fā)生發(fā)展；（3）MMP-9 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平的檢測可能有助于了解其病情發(fā)展狀況。