楊越趙航陳建寧李廷利

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理教研室，黑龍江 哈爾濱150040）

恐懼是生物的一種基本感情，與生物的進(jìn)化密切相關(guān)，它對(duì)人類的生存起到重要的作用，能夠激發(fā)一系列的機(jī)體防御機(jī)制［1］。 研究表明，海馬［2］、杏仁核復(fù)合體、外側(cè)隔核、丘腦部分亞區(qū)［3］、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)［4］等皮層下結(jié)構(gòu)及高級(jí)皮層前扣帶回等為主要參與核團(tuán)。

睡眠障礙與恐懼情緒之間往往是相互伴生。 條件性恐懼動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥鳛榻?jīng)典的恐懼情緒研究模型，源于巴甫洛夫經(jīng)典條件反射，廣泛應(yīng)用于對(duì)恐懼的習(xí)得、表達(dá)、消退和復(fù)原的研究以及學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)機(jī)制研究。

朱砂安神丸首載于李杲的《內(nèi)外傷辨惑論·卷中·飲食勞倦論》，由當(dāng)歸、甘草、黃連、地黃及朱砂組成［5］。 近年來研究表明，朱砂安神丸具有改善睡眠及治療多種精神疾病的作用。 王瑩等［6］的實(shí)驗(yàn)表明，朱砂安神丸可以促進(jìn)恐懼的記憶消退。 還有促進(jìn)恐懼記憶消退、保護(hù)海馬神經(jīng)元、增強(qiáng)海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能的可塑性［7］。 但朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼導(dǎo)致睡眠障礙的治療研究較少。

本實(shí)驗(yàn)通過條件性恐懼習(xí)得、消退過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的僵直時(shí)間和對(duì)恐懼習(xí)得和消退過程大鼠皮層腦電的描記，探究朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠條件性恐懼習(xí)得和消退及在此過程中的覺醒-睡眠時(shí)間的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，SPF 級(jí)，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑）2018-003。

1.1.2 儀器與試劑條件性恐懼實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào)：XR-XC404-2）；條件性恐懼實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào)：SuperFcs）；大鼠獨(dú)立通氣籠IVC（蘇杭科技器材有限公司，型號(hào)：RU25H5）；朱砂安神丸（吉林省鑫輝藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170701）

1.2 方法

1.2.1 朱砂安神丸的制備根據(jù)藥品使用說明書得知成人服用最大劑量為9 g，根據(jù)體表面積折算法計(jì)算出大鼠的灌胃劑量0.81 g／kg，依據(jù)藥物濃度及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可服用劑量，確定給藥量為0.9 mL／100 g。朱砂安神丸供試液配制方法：精密稱取朱砂安神丸9.00 g，放置于研缽中，加入1%羧甲基纖維素鈉（CMC）至朱砂安神丸懸浮，轉(zhuǎn)移定容至100 mL 容量瓶中。

1.2.2 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼習(xí)得記憶的影響選取雄性SD 大鼠30 只，適應(yīng)環(huán)境1 周后，隨機(jī)分成空白組、模型組、給藥組，每組10 只。 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃給予朱砂安神丸7 d，空白組和模型組給予等量的1%CMC。 7 d 內(nèi)每日灌胃1 次，給藥時(shí)間在7：00—7：40 之間。 第7 日灌胃結(jié)束后，參照唐霜等［7］文章方法進(jìn)行條件性恐懼模型的復(fù)制和條件性恐懼記憶習(xí)得測(cè)試，除空白組外各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均進(jìn)行足底電刺激。

1.2.3 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼記憶消退的影響選取雄性SD 大鼠30 只，適應(yīng)環(huán)境1 周后，隨機(jī)分成空白組、模型組及給藥組，每組10 只。 實(shí)驗(yàn)組灌胃給予朱砂安神丸7 d，空白組和模型組給予等量的1%的CMC。 模型復(fù)制的第2 天開始進(jìn)行給藥處理，連續(xù)6 d，每天灌胃1 次，給藥時(shí)間為7：00—7：20 之間。 第2 天起，參照唐霜等［7］文章方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的恐懼記憶消退，恐懼記憶的消退在連續(xù)的6 d 內(nèi)進(jìn)行，每天1 次，消退時(shí)間在8：00—9：00之間進(jìn)行。

1.2.4 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼習(xí)得過程覺醒-睡眠時(shí)間及睡眠時(shí)相的影響選取雄性SD 大鼠30 只，適應(yīng)環(huán)境1 周后，隨機(jī)分成空白組、模型組及給藥組，每組10 只。 將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行皮層腦電及肌電電極埋置手術(shù)，術(shù)后將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單籠飼養(yǎng)4 d。 之后進(jìn)行藥物干預(yù)處理，給藥的第1 ～7 天對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行灌胃處理，給藥時(shí)間在7：00—7：30。 在第7 天給藥結(jié)束后進(jìn)行條件性恐懼模型復(fù)制。 模型復(fù)制結(jié)束后將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連接至16 道生理記錄儀中，連續(xù)記錄24 h。

利用Sleep Sign 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以每10 秒為1 幀，根據(jù)大鼠EEG 及EMG，以每4 小時(shí)為1 個(gè)單位對(duì)大鼠睡眠-覺醒進(jìn)行分析。

根據(jù)大鼠EEG 及EMG 波形，將大鼠的睡眠-覺醒周期分為3 個(gè)階段：

非快動(dòng)眼（NREM）期：EMG 明顯減弱，振幅較??；EEG 以紡錘波和低頻高幅波形為主，大鼠行為表現(xiàn)為閉目，全身靜臥不動(dòng)，或埋頭蜷身熟睡。 快動(dòng)眼（REMS）期：EEG 表現(xiàn)為低幅高頻信號(hào)的θ 波，EMG 消失。 覺醒（Wake）期：大鼠活動(dòng)明顯，EMG 波動(dòng)較為劇烈，EEG 則以不規(guī)則的高頻低幅信號(hào)為主。

1.2.5 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼記憶消退過程中覺醒-睡眠時(shí)間及睡眠時(shí)相的影響選取雄性SD 大鼠30 只，適應(yīng)環(huán)境1 周后，隨機(jī)分成空白組、模型組及給藥組，每組10 只。 將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行皮層腦電及肌電電極埋置手術(shù)，術(shù)后將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單籠飼養(yǎng)4 d。 之后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于條件性恐懼刺激箱中，進(jìn)行條件性恐懼模型復(fù)制。 模型復(fù)制的第2～7 天對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行灌胃給藥，時(shí)間在7：00—7：30。 每天灌胃結(jié)束后，于8：00—11：00 將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依次放入條件性恐懼刺激箱中進(jìn)行條件性恐懼消退。 每天消退結(jié)束后將大鼠連接至16道生理記錄儀中，連續(xù)描記皮層腦電12 h。

利用Sleep Sign 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以每10 秒為1 幀，根據(jù)大鼠EEG 及EMG，以每4 小時(shí)為1 個(gè)單位對(duì)大鼠睡眠-覺醒進(jìn)行分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼記憶習(xí)得的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組條件性恐懼習(xí)得過程中，第1～5 個(gè)周期內(nèi)僵直反應(yīng)時(shí)間明顯增加（P＜0.01），給藥組與模型組在第1～5 個(gè)周期內(nèi)的僵直反應(yīng)時(shí)間無差異。 見圖1。

圖1 條件性恐懼習(xí)得過程中各組大鼠僵直反應(yīng)時(shí)間Figure 1 Stiff reaction time of rats in each group during conditional fear acquisition

2.2 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼記憶消退的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在條件性恐懼消退階段，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物僵直反應(yīng)時(shí)間隨消退時(shí)間增加而逐漸減少；與空白組相比，模型組在第2 ～4 天僵直反應(yīng)時(shí)間增加（P＜0.01）；第5 天模型組的僵直反應(yīng)時(shí)間增加（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組在第4、5 天的僵直反應(yīng)時(shí)間減少（P＜0.05）。 見圖2。

圖2 條件性恐懼記憶消退階段各組大鼠的僵直反應(yīng)時(shí)間Figure 2 Stiff reaction time of rats in each group in the phase of conditional fear memory fading

2.3 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼習(xí)得過程覺醒-睡

眠時(shí)間及睡眠時(shí)相的影響

2.3.1 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼習(xí)得過程中Wake 時(shí)間及百分比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第1 ～3個(gè)周期，Wake 時(shí)間均有延長（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組在第1、2 個(gè)周期Wake 時(shí)間縮短（P＜0.05）。 與空白組相比，模型組在第1、2 個(gè)周期內(nèi)，Wake 期百分率提高（P＜0.05）；在第3 個(gè)周期內(nèi)，Wake 時(shí)間百分比增加（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組在第1～3 個(gè)周期Wake 時(shí)間百分比降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 條件性恐懼習(xí)得過程中各組大鼠Wake 時(shí)間及百分比Figure 3 Wake time and percentage of rats in each group during conditional fear acquisition

2.3.2 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼習(xí)得過程中睡眠總時(shí)間及百分比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第1 ～3個(gè)周期內(nèi)，睡眠總時(shí)間縮短（P＜0.01 或P＜0.05）；與模型組相比，給藥組第1 ～3 個(gè)周期內(nèi)的睡眠時(shí)間明顯高于模型組（P＜0.01）；與空白組相比，模型組在第1～3 個(gè)周期內(nèi)，睡眠時(shí)間百分比縮短（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組相比較，給藥組第1～3 個(gè)周期內(nèi)的睡眠時(shí)間百分比高于模型組（P＜0.05）。 見圖4。

2.3.3 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼習(xí)得過程中REMS 時(shí)間及百分比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第1 ～3個(gè)周期內(nèi)，REMS 時(shí)間減少（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組在第2 個(gè)周期內(nèi)，REM 時(shí)間明顯增加（P＜0.01）；第1 個(gè)周期和第3 個(gè)周期內(nèi)REM 時(shí)間增加（P＜0.05）；3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物REMS 時(shí)間百分比無明顯變化。 見圖5。

2.3.4 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼習(xí)得過程中NREM 時(shí)間及百分比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第1 ～3個(gè)周期內(nèi)，NREM 時(shí)間減少（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，給藥組在第1～3 個(gè)周期內(nèi)，NREM 時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NREM 時(shí)間百分比無明顯變化。 見圖6。

圖4 條件性恐懼習(xí)得過程中各組大鼠睡眠總時(shí)間及百分比Figure 4 Total sleep time and percentage of rats in each group during conditional fear acquisition

圖5 條件性恐懼習(xí)得過程中各組大鼠REMS 時(shí)間及百分比Figure 5 REMs time and percentage of rats in each groupduring conditioned fear acquisition

圖6 條件性恐懼習(xí)得過程中各組大鼠NREM 時(shí)間及百分比Figure 6 NREM time and percentage of rats in each group during conditioned fear acquisition

2.4 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼消退過程中覺醒-睡眠時(shí)間及睡眠時(shí)相的影響

2.4.1 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼記憶消退過程中Wake 時(shí)間及百分比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第2 ～4天，Wake 時(shí)間增加（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在第4、5 天Wake 時(shí)間明顯減少（P＜0.05）；與空白組相比，模型組在第2 ～4 天，Wake 時(shí)間百分比增加（P＜0.01）；在第5 天Wake 時(shí)間百分比增加（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在條件性恐懼消退第4、5 天Wake 時(shí)間百分比明顯減少（P＜0.05）。 見圖7。

2.4.2 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼記憶消退過程中睡眠時(shí)間及百分比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第2 ～4天，睡眠時(shí)間減少（P＜0.01）；第5 天睡眠時(shí)間減少（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組在第4、5 天睡眠時(shí)間增加（P＜0.05）。 與空白組相比，模型組在第2 ～4 天，睡眠總時(shí)間百分比降低（P＜0.01）；第5 天模型組睡眠時(shí)間百分比降低（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在第4、5 天睡眠時(shí)間百分比增加（P＜0.05）。見圖8。

圖7 條件性恐懼記憶消退過程中各組大鼠Wake 時(shí)間及百分比Figure 7 Wake time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

圖8 條件性恐懼記憶消退過程中各組大鼠睡眠時(shí)間及百分比Figure 8 Sleep time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

2.4.3 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼記憶消退過程中REMS 時(shí)間百分比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第2～5天，REMS 時(shí)間均有減少（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在第4 天REM 時(shí)間增加（P＜0.05）。見圖9。 3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物REMS 時(shí)間百分比無明顯變化。

2.4.4 朱砂安神丸對(duì)大鼠條件性恐懼記憶消退過程中NREM 時(shí)間及百分比的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第2～4天，NREM 時(shí)間明顯減少（P＜0.01）；第5 天，NREM時(shí)間減少（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組在第4天，NREM 時(shí)間明顯增加（P＜0.01），第5 天NREM時(shí)間增加（P＜0.05）。 見圖10。 3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NREM時(shí)間百分比無明顯變化。

圖9 條件性恐懼記憶消退過程中各組大鼠REMS 時(shí)間及百分比Figure 9 REMs time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

圖10 條件性恐懼記憶消退過程中各組大鼠NREM 時(shí)間及百分比Figure 10 NREM time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

3 討論

恐懼是人們面臨威脅性情境時(shí)的一種情緒反應(yīng)，在恐懼條件反射和恐懼消除測(cè)試的早期階段最明顯，杏仁核儲(chǔ)存恐懼記憶，并對(duì)厭惡經(jīng)歷期間儲(chǔ)存于其他腦域的情感記憶進(jìn)行調(diào)節(jié)。 即杏仁核神經(jīng)元儲(chǔ)存恐懼記憶并易化儲(chǔ)存在其他腦域的恐懼記憶［8］。

條件性恐懼模型作為研究恐懼學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物將中性刺激CS 出現(xiàn)后接著匹配厭惡性刺激US，多次訓(xùn)練后CS 轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件刺激，進(jìn)而引發(fā)行為和生理上的反應(yīng)。 睡眠障礙與恐懼情緒之間往往是相互伴生，創(chuàng)傷性事件造成的恐懼情緒會(huì)引發(fā)睡眠障礙，而睡眠障礙又會(huì)對(duì)恐懼情緒的習(xí)得和表達(dá)產(chǎn)生影響。 當(dāng)恐懼情緒產(chǎn)生時(shí)，往往伴隨著失眠或噩夢(mèng)等。 因此可以推斷，恐懼與睡眠障礙的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制可能會(huì)有共同點(diǎn)。

有研究表明，外側(cè)杏仁核內(nèi)的去甲腎上腺系統(tǒng)參與了恐懼記憶的習(xí)得及鞏固過程，通過阻斷杏仁核內(nèi)的β 受體可以破壞恐懼記憶的習(xí)得及鞏固［9-10］。 研究表明，條件性恐懼可造成大鼠睡眠障礙，原因可能是條件性恐懼能夠增強(qiáng)LC-NA 的活動(dòng)，進(jìn)而投射至杏仁核的NA 神經(jīng)纖維直接激活杏仁核［11］。 LC-NA 神經(jīng)不僅參與恐懼的消退，也參與恐懼的表達(dá)，過高的LC-NA 功能抑制前額葉皮質(zhì)功能，減弱了消退過程中前額葉皮質(zhì)對(duì)杏仁核的抑制，表現(xiàn)為恐懼表達(dá)增強(qiáng)［12］。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，給藥組表現(xiàn)為隨消退時(shí)間增加，僵直時(shí)間逐漸減少，可能原因?yàn)橹焐鞍采裢杩梢种芁C-NA 神經(jīng)功能，一方面可能通過抑制NA 神經(jīng)的功能進(jìn)而降低了NA 對(duì)前額葉皮質(zhì)（PFC）的抑制作用［13］；另一方面恢復(fù)海馬內(nèi)受損的神經(jīng)元，促進(jìn)消退記憶寫入前額葉皮質(zhì)［14］，增強(qiáng)前額葉皮質(zhì)對(duì)杏仁核的控制作用，減少了恐懼的表達(dá)；朱砂安神丸能提升恐懼習(xí)得后的睡眠時(shí)長，縮短睡眠障礙恢復(fù)時(shí)間，其原因可能是朱砂安神丸能抑制下丘腦室旁核（PVN），降低LC-NA 神經(jīng)元的興奮性，使睡眠障礙逐漸恢復(fù)。

綜上所述，條件性恐懼能夠引起覺醒時(shí)間延長，睡眠時(shí)間縮短而對(duì)REM 及NREM 的睡眠比例無影響；朱砂安神丸能夠促進(jìn)條件性恐懼消退；朱砂安神丸能夠拮抗由條件性恐懼引起的睡眠障礙。 關(guān)于朱砂安神丸拮抗條件性恐懼引起的睡眠障礙的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。