魏泉增，王磊，肖付剛*

(1.許昌學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標識快檢技術(shù)重點實驗室,河南 許昌 461000)

花椒是中國傳統(tǒng)的調(diào)味品之一?；ń分械膿]發(fā)性有效成分具有溫中行氣、逐寒、止痛、殺蟲、抗腫瘤、麻醉等功效[1-3]。由于花椒產(chǎn)地的差異，導(dǎo)致成熟后花椒的揮發(fā)性有效成分有所差異。因此，分析不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性成分具有重要意義。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、電子鼻技術(shù)、氣相色譜技術(shù)常用來分析揮發(fā)性物質(zhì)[4-7]。羅凱等[8]用GC-MS技術(shù)檢測分析了4 個不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)油成分含量的差異。楊崢等[9]利用GC-O技術(shù)結(jié)合芳香萃取物稀釋分析法對金陽青花椒香氣活性成分進行檢測分析。莫彬彬等[10]用超臨界二氧化碳法萃取九葉青花椒揮發(fā)油并鑒定出63個化合物。楊靜等[11]采用快速氣相電子鼻區(qū)分不同地區(qū)的青花椒。目前，對花椒揮發(fā)性成分研究較多[12，13]，但并沒有找出特征物質(zhì)加以區(qū)分。本研究比較不同提取方法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，尋找區(qū)分不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性成分特征物質(zhì)，為花椒綜合利用提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：洛陽花椒、漢源花椒、自貢花椒、山東花椒、鄭州花椒5種花椒，均購自當?shù)爻?，花椒打?0 s，過40目篩，備用；二氯甲烷:百靈威公司。

7890B-7000C GC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技公司；65 μm ACAR/PDMS(活性炭/聚二甲基硅氧烷)手動固相微萃取裝置及萃取探針 青島貞正分析儀器有限公司；揮發(fā)油提取器(500 mL) 鄭州興華玻璃儀器公司；同時蒸餾萃取器(1000 mL) 賽克斯玻璃儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法(WD)

稱取10.00 g山東花椒，置于250 mL的圓底燒瓶中，加入100 mL的蒸餾水緩慢蒸餾2 h。待冷卻至室溫后，上層淡黃色液體用0.45 μm有機系濾膜過濾后進行GC-MS分析[14]。

1.2.2 同時蒸餾萃取法(SD)

稱取10.00 g山東花椒，置于500 mL的圓底燒瓶中，加入100 mL的蒸餾水，電爐加熱。取40 mL的二氯甲烷加入250 mL的圓底燒瓶中，60 ℃水浴加熱，同時萃取2 h。用0.45 μm有機系濾膜過濾后進行GC-MS分析。

1.2.3 頂空固相微萃取法(SPME)

取不同產(chǎn)地的花椒樣品0.50 g放入15 mL的頂空瓶中，60 ℃水浴恒溫平衡30 min，SPME吸附30 min，250 ℃解吸附3 min[15]，進行GC-MS分析。

1.3 氣相色譜條件

色譜柱：DB-WAX聚乙二醇(PEG)色譜柱，60 m×0.25 mm×0.25 μm。升溫程序：以50 ℃為初始溫度，以5 ℃/min升至100 ℃，以2 ℃/min 升至110 ℃，以5 ℃/min升至150 ℃，以4 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。載氣(He)流速1.2 mL/min，分流比100∶1，汽化室溫度250 ℃。液體進樣量1 μL，SPME解吸附3 min。

1.4 質(zhì)譜條件

EI離子源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，溶劑延遲6.5 min，掃描方式Scan，質(zhì)量范圍29～700 amu。

1.5 GC-MS數(shù)據(jù)分析

NIST 14譜庫檢索，選取匹配度大于80%的物質(zhì)。以檢測到的物質(zhì)保留時間為有效響應(yīng)點，以保留時間-峰面積歸一化法為數(shù)據(jù)集，重復(fù)3次。采用模型為VaR-CoVaR對不同產(chǎn)地花椒進行PCA分析，相似度采用Dice法進行不同產(chǎn)地花椒聚類分析，根據(jù)PCA分析結(jié)果，對不同產(chǎn)地花椒進行特征分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法比較

3種提取方法結(jié)合GC-MS分析山東產(chǎn)地花椒，結(jié)果表明醇類和烯類化合物是花椒香氣物質(zhì)的主要化合物。3種提取方法檢測到花椒揮發(fā)油化合物種類不同，WD法提取到43種揮發(fā)性化合物，SD法提取到37種化合物，SPME提取到41種化合物。

圖1 山東產(chǎn)地花椒不同方法提取香氣物質(zhì)Fig.1 Different methods for extraction aroma componentsfrom Zanthoxylum bungeanum in Shandong Province

由圖1可知，3種方法都提取到了醇類、烴類、酮類、醛類、烯類和酯類，其中峰面積最大的是WD法，峰面積最小的是SD法；只有SD法提取到醚類，而且峰面積很?。恢挥蠾D法提取到酸類；WD法和SPME法提取到烷類。

圖2 不同提取方法總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of different extraction methods

由圖2可知，WD法、SPME法和SD法的色譜圖相似，WD法的色譜圖峰高偏高，峰寬較寬，分離度不好，處理時間較長，操作溫度較高，會導(dǎo)致新的物質(zhì)產(chǎn)生，利用NIST庫檢索物質(zhì)的匹配度較低。SPME法操作溫度適中，操作時間短，庫匹配度高，故SPME法較優(yōu)。

2.2 不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性物質(zhì)比較

SPME法共提取到77個揮發(fā)性化合物，見表1，包括17種醇類，2種醛，5種酮，17種烷，27種烯，9種酯類。檸檬烯是含量最多的化合物，鄭州花椒最高，達到267.16‰，乙酸芳樟酯次之，達254.56‰。但不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性種類含量差異明顯(見圖3)，醇類化合物中洛陽花椒含量最多，自貢花椒最少。烯類化合物中鄭州花椒含量最多，山東花椒含量最少。酮類化合物山東花椒含量最多，自貢花椒含量最少。酯類化合物自貢花椒最多，山東花椒最少。5種產(chǎn)地中烯類化合物含量最多，其次是醇類化合物，酮類和酯類化合物相對較少，這與楊瀟等的分析結(jié)果相似[16]。5個產(chǎn)地都檢測到萜二烯、3-亞甲基-6-(1-甲基乙基)環(huán)己烯、1,5,9,9-四甲基-α-丁子香烯和雙環(huán)[1]庚-2-烯，3,6,6-三甲基烯類化合物中。5個產(chǎn)地都檢測的醇類化合物3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇、芳樟醇、桉油精。乙酸芳樟酯在5個產(chǎn)地都檢測到。5個產(chǎn)地共有的酮類化合物為4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-酮。不同產(chǎn)地花椒的相對含量差異較大，例如，乙酸松油酯在漢源花椒中含量達到138.46‰，在洛陽花椒中達77.51‰，在山東花椒中達49.9‰，鄭州和自貢花椒含量相似分別為29.71‰、28.01‰。同時，不同產(chǎn)地提取一些特有化合物，δ-松油醇只在漢源花椒中檢測到，對甲基苯異丙醇只在洛陽花椒中檢測到，3-(4-甲基-3-戊烯基)-呋喃只在鄭州花椒中檢測到，乙酸辛酯只在山東花椒中檢測到，這為區(qū)分不同產(chǎn)地的花椒提供了參考依據(jù)。

圖3 SPME法不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性香氣種類分布圖Fig.3 Distribution of volatile aroma components' types ofZanthoxylum bungeanum from different producingareas by SPME method

表1 SPME提取不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Extraction of volatile components from Zanthoxylum bungeanum in different producing areas by SPME ‰

續(xù) 表

續(xù) 表

注：“-”表示未檢出。

2.3 聚類分析

5個產(chǎn)地的花椒揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析見圖4。15個樣品分成3組，1組自貢樣品，2組鄭州和漢源樣品，3組洛陽和山東樣品，鄭州和漢源花椒香氣成分相似度較高，而洛陽和山東花椒相似度較高，自貢與其他產(chǎn)地花椒相似度較小。

由圖4可知，鄭州和漢源的相似度為0.62，洛陽和山東的相似度為0.64，自貢和其他產(chǎn)地的花椒相似度為0.51，結(jié)果表明不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性組成差異性明顯。

圖4 聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram

2.4 主成分分析

主成分的分析(PCA)是一種降維或者把多個指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標的一種多元數(shù)理統(tǒng)計方法，對5個產(chǎn)地花椒樣品進行PCA分析，得到分值圖(見圖5)和載荷圖(見圖6)。結(jié)果表明第一主成分的貢獻率為51.05%，第二主成分的貢獻率為21.69%。

圖5 花椒分值圖Fig.5 Score chart of Zanthoxylum bungeanum

由圖5可知，鄭州、洛陽、山東、自貢、漢源5個產(chǎn)地具有明顯差異，這為區(qū)分不同產(chǎn)地的花椒提供了潛在的線索。

圖6 載荷圖 Fig.6 Loading plot

注：圖中的數(shù)字對應(yīng)表1中。

由圖6可知，被分析化合物對主成分的影響，化合物遠離原點表明這個化合物對主成分有強烈的影響，36號物質(zhì)乙酸芳樟酯和30號物質(zhì)乙酸松油酯可能成為區(qū)分不同產(chǎn)地花椒的關(guān)鍵化合物，為區(qū)分不同產(chǎn)地花椒奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

采用水蒸氣蒸餾法(WD)、固相微萃取法(SPME)和同時蒸餾法(SD)3種提取方法結(jié)合GC-MS分析山東花椒揮發(fā)性化合物組成，SPME提取方法最優(yōu)。采用SPME提取法結(jié)合GC-MS分析5個產(chǎn)地花椒，共鑒定到77種化合物。其中，乙酸熏衣草酯是山東產(chǎn)地花椒獨有的酯類化合物，香芹酮是自貢花椒獨有的酮類化合物，香葉基乙烯基醚是山東產(chǎn)地獨有的醚類化合物，檸檬烯是花椒主要的化合物，含量高。聚類分析和主成分分析表明不同產(chǎn)地之間香味物質(zhì)的差異明顯；乙酸芳樟酯和乙酸松油酯成為區(qū)分不同產(chǎn)地花椒的潛在關(guān)鍵化合物。