羅青，楊玉珍，王國霞，陳剛

(鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450044)

隨著人們生活水平的提高及消費觀念的轉(zhuǎn)變，食用菌的營養(yǎng)和健康價值逐漸受到人們的關(guān)注，從食用菌出發(fā)進行復(fù)合調(diào)味品的研究也逐漸增多[1]。

在諸多食用菌中，金針菇與杏鮑菇是兩種常見且應(yīng)用廣泛的菌類。金針菇又名樸菇，隸屬于真菌門，擔子菌亞門，層菌目，口蘑科，金錢菌屬。它被稱之為智力菇，因其中所含賴氨酸和精氨酸比較多，分別達1.024%和1.231%[2]，可以促進兒童的智力發(fā)育。杏鮑菇又稱刺芹側(cè)耳，其中所含精氨酸和谷氨酸含量很高，同時，這兩種菌類都具有促進腸胃消化,降血脂,降低膽固醇,防止心血管疾病,增強機體免疫能力,抗氧化,抗病毒等藥用功效[3,4]。其中金針菇多糖是金針菇中所含的主要有效生物活性成分，它具有抑制腫瘤、抗癌和增強機體免疫力等作用[5]，同樣在杏鮑菇中也含有豐富的多糖類物質(zhì)，具有降血糖和非常強的免疫調(diào)節(jié)作用[6,7]。因此，可以將兩種菌類在食品、調(diào)味品等工業(yè)中加以應(yīng)用，如功能型調(diào)味品的開發(fā)，會有廣闊的應(yīng)用前景。

目前食用菌功能型復(fù)合調(diào)味品可利用菌絲體發(fā)酵液做成調(diào)味汁[8]，但大多采用的都是單一食用菌，如香菇醬油、草菇老抽等[9]，而將兩種或兩種以上的食用菌用于調(diào)味品的發(fā)酵生產(chǎn)還很少見[10]?；旌习l(fā)酵是指采用兩種或多種微生物在協(xié)同作用下共同完成某發(fā)酵過程。目前在食用菌方面進行混合發(fā)酵的研究還較少，其中苗敬芝等[11]曾研究過靈芝和金針菇混合發(fā)酵-蘆薈復(fù)合保健飲料，結(jié)果表明，保健飲料口感好，營養(yǎng)也比較全面，遠高于純種發(fā)酵。食用菌的混合發(fā)酵也將會加大應(yīng)用研究[12]。本課題試驗將對金針菇和杏鮑菇這兩種大型真菌的菌絲體進行混合發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化混合發(fā)酵的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，并對兩者混合發(fā)酵液多糖產(chǎn)生情況進行探究，可為金針菇和杏鮑菇功能型復(fù)合調(diào)味品產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌種

杏鮑菇母種；金針菇母種，生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室分離保存。

1.1.2 試驗試劑

馬鈴薯(超市購買)；葡萄糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖、果糖(均為分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、黃豆粉、酵母粉(均為生化試劑)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaNO3、NH4NO3、Na2SO4、MgSO4、K2SO4、FeSO4、CuSO4、KH2PO4(均為分析純)：天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司；蒽酮、80%硫酸(均為分析純)：上海展云化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：去皮馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂20 g；自來水1000 mL；pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g；碳源20 g；氮源20 g；KH2PO42 g；無機鹽1 g；清水10000 mL；pH自然。

所有培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌，121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 常州市賽維思環(huán)境試驗設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺 蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司；TS-100B恒溫搖床 上海安競實驗設(shè)備有限公司；T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金針菇、杏鮑菇菌種活化

將金針菇和杏鮑菇的試管菌種挑取1環(huán)接種到新鮮的PDA平板培養(yǎng)基上，于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，待菌絲長出備用。

1.3.2 菌絲體量的測定

將發(fā)酵液用濾紙過濾留菌絲體于濾紙上，自然晾干菌絲團明水后于電子天平上稱重。

1.3.3 單因素試驗——混合發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中保持其他成分不變，分別加入葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉5種不同的碳源[13]，嚴格按照無菌操作，用鑷子各取1 cm正方形大小的杏鮑菇和金針菇菌絲塊接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，再做兩組各自單獨接入金針菇和杏鮑菇菌絲塊作為對照。每組3個重復(fù)。放置到110 r/min搖床于26 ℃培養(yǎng)，每隔7 d進行菌絲重量測量，培養(yǎng)21 d后對其發(fā)酵液進行多糖含量測定。根據(jù)菌絲量變化和多糖含量變化確定最佳碳源。

1.3.4 單因素試驗——混合發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

在確定最適碳源營養(yǎng)后，發(fā)酵液中其他成分不變，將培養(yǎng)基中的氮源分別添加蛋白胨、NaNO3、NH4NO3、黃豆粉、酵母粉10 g[14]，同1.3.3法接種培養(yǎng)和測定，篩選出金針菇杏鮑菇混合發(fā)酵的最佳氮源。

1.3.5 單因素試驗——混合發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽的優(yōu)化

同1.3.3方法培養(yǎng)分別添加NaSO4、MgSO4、K2SO4、FeSO4、CuSO4作為無機鹽參考，篩選出金針菇杏鮑菇混合發(fā)酵的最佳無機鹽營養(yǎng)。

1.3.6 單因素試驗——混合發(fā)酵條件溫度的優(yōu)化

將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定在20,22,24,26,28 ℃，根據(jù)菌絲生長量和多糖濃度，篩選出金針菇杏鮑菇混合發(fā)酵的最佳溫度。

1.3.7 單因素試驗——混合發(fā)酵條件轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

將金針菇杏鮑菇發(fā)酵液培養(yǎng)轉(zhuǎn)速設(shè)置為70,90,110,130,150 r/min 5個梯度進行培養(yǎng)，根據(jù)菌絲生長量和多糖濃度，篩選出金針菇杏鮑菇混合發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速。

1.3.8 多糖濃度測定

分別取0.1 g/L的葡萄糖溶液0.01,0.02,0.03,0.04,0.06,0.08,0.1,0.12 mL用蒸餾水補至1 mL，分別加入6 mL蒽酮試劑，每個試管加完之后一起浸入沸水浴中，試管口加上蓋子以防止蒸發(fā)。沸水浴15 min取出，用自來水冷卻，于620 nm比色。以同樣處理的重蒸餾水為空白，進行比色，以糖含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得標準曲線y=5.7433x+0.0097,R2=0.9956，見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

取樣品1 mL，加入6 mL蒽酮試劑，同標準曲線操作，比色測定，根據(jù)標準曲線方程計算含量。

1.3.9 正交試驗

將單因素試驗所得的最佳碳源、氮源、無機鹽，采用三因素三水平進行L9(33)正交試驗[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同碳源對混合菌絲的生長影響

(a)蔗糖

(b)果糖

(c)麥芽糖

(d)葡萄糖

(e)淀粉

(f)碳源

由圖2可知，不同碳源對混合發(fā)酵及單獨菌液發(fā)酵的影響中，麥芽糖、蔗糖為碳源時對菌絲生長影響最大，菌絲重量增加最顯著，21 d培養(yǎng)菌絲重量達到(7.32±0.39) g，綜合其影響的顯著性,各碳源的影響排列順序為麥芽糖>蔗糖>果糖>葡萄糖>淀粉，而且數(shù)據(jù)明顯表明混合發(fā)酵的菌絲增加量要比純種發(fā)酵菌絲生長增加量高。

2.1.2 不同氮源對混合菌絲生長的影響

(a)黃豆粉

(b)蛋白胨

(c)酵母粉

(d)NH4NO3

(e)NaNO3

(f)氮源

由圖3可知，不同氮源對混合發(fā)酵和純種發(fā)酵的影響皆有不同，混合發(fā)酵菌絲生長的比較快，其中蛋白胨對菌絲的生長速率影響最大，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(6.31±0.25) g，以蛋白胨為氮源時混合發(fā)酵的菌絲重量增加最大，其次是黃豆粉和NH4NO3，兩者差別不太大。綜合各種氮源的影響排列順序為蛋白胨>黃豆粉>NH4NO3>酵母粉>NaNO3。

2.1.3 不同無機鹽對混合菌絲生長的影響

(a)FeSO4

(b)CuSO4

(c)K2SO4

(d)Na2SO4

(e)MgSO4

(f)無機鹽

由圖4可知，不同無機鹽對混合發(fā)酵和純種發(fā)酵的影響也各有不同，同樣是混合發(fā)酵的菌絲生長量要比純種發(fā)酵快，其中FeSO4對菌絲的生長速率影響最大，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(7.32±0.05)g，各種無機鹽對菌絲的生長影響的主次順序為FeSO4>K2SO4>CuSO4>MgSO4>Na2SO4。

2.1.4 溫度對混合發(fā)酵液的影響

(a)20 ℃

(b)22 ℃

(c)24 ℃

(d)26 ℃

(e)28 ℃

(f)溫度

由圖5可知，不同溫度對混合發(fā)酵的影響要比純種發(fā)酵的影響大，其中在26 ℃時菌絲的生長最快，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(5.88±0.32) g，兩邊均呈下降趨勢，分析其原因發(fā)現(xiàn)低溫條件下菌絲生長緩慢，而溫度過高也會抑制菌絲的生長[16]。

2.1.5 轉(zhuǎn)速對混合發(fā)酵液的影響

(a)70 r/min

(b)90 r/min

(c)110 r/min

(d)130 r/min

(e)150 r/min

(f)轉(zhuǎn)速

由圖6可知，不同轉(zhuǎn)速對混合發(fā)酵種菌絲生長的影響也要比純種發(fā)酵的影響大，其中轉(zhuǎn)速為110 r/min時菌絲的生長速率最大，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(6.11±0.17) g。在搖床過程中高轉(zhuǎn)速會導(dǎo)致菌絲過密[17]，且容易污染，相反，低轉(zhuǎn)速又會影響營養(yǎng)物質(zhì)的傳導(dǎo)和溶氧量，不利于混合菌絲的生長[18]。

2.2 多糖濃度測定結(jié)果

(a) 不同碳源發(fā)酵液的多糖濃度

(b) 不同氮源發(fā)酵液的多糖濃度

(c) 不同無機鹽發(fā)酵液的多糖濃度

(d) 不同溫度發(fā)酵液的多糖濃度

(e) 不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵液的多糖濃度

由圖7可知，金針菇和杏鮑菇混合發(fā)酵液的多糖濃度大部分是高于其純種發(fā)酵液含量的，由圖7各條件下多糖的濃度可以看出菌絲的最高生長量與多糖最大濃度并不統(tǒng)一，如果以多糖濃度為參考指標，發(fā)酵液產(chǎn)出多糖濃度最高的條件為：碳源為果糖時多糖濃度最高為(3.08±0.03)%，氮源為蛋白胨時多糖濃度最高為(3.21±0.02)%，無機鹽為MgSO4時多糖濃度最高為(3.39±0.09)%，溫度為26 ℃時多糖濃度最高為(3.39±0.01)%，轉(zhuǎn)速為130 r/min時多糖濃度最高為(3.39±0.03)%。

2.3 正交試驗結(jié)果分析

正交試驗因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment %

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可知不同碳源比例對混合發(fā)酵中菌絲的生長有很大的影響，根據(jù)極差分析結(jié)果得出，碳源在整個實驗因素中影響最大，其次為氮源，最后是無機鹽，碳源和氮源很接近。比較K值可得出最佳配方A2B2C2，即碳源果糖含量為2%、氮源蛋白胨含量為2%、無機鹽MgSO4含量為0.5%。

3 結(jié)論與討論

通過不同碳源、氮源、溫度、轉(zhuǎn)速、無機鹽的篩選，得到金針菇與杏鮑菇混合發(fā)酵菌絲生長量最高的條件：麥芽糖為碳源，蛋白胨為氮源，無機鹽為FeSO4，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為110 r/min。金針菇與杏鮑菇混合發(fā)酵多糖含量最高的發(fā)酵條件：果糖為碳源，蛋白胨為氮源，無機鹽為MgSO4，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min。本研究表明混合發(fā)酵生長效果要比純種發(fā)酵生長速度快多，發(fā)酵液多糖含量混合菌也要高于純種發(fā)酵的多糖含量。

本試驗利用金針菇和杏鮑菇混合液體發(fā)酵培養(yǎng)的互利協(xié)同作用，很大地提高了金針菇和杏鮑菇單一發(fā)酵的生產(chǎn)價值，可以在食用菌復(fù)合調(diào)味品的研究中進行應(yīng)用，其中多糖含量的增加可以進一步提高調(diào)味品的保健功能[19]，而發(fā)酵速度的增加可以縮短調(diào)味品生產(chǎn)發(fā)酵周期。該試驗研究為今后食用菌相關(guān)食品、調(diào)味品工業(yè)等方面的開發(fā)利用提供了新的技術(shù)支持。