柴洋洋,王雨萱,艾凱,王鑫,艾琛

(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，對(duì)食物的追求不僅僅停留在美味上， 而是更加注重食物的健康與保健，因此具有調(diào)味和營(yíng)養(yǎng)雙重作用的復(fù)合調(diào)味劑應(yīng)運(yùn)而生。食用菌在鮮味劑方面的應(yīng)用成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

茶樹(shù)菇(Agrocybecylindracea)是擔(dān)子菌綱(Basidiomycete)的一種食用菌和藥用真菌，其具有人體所需的8種氨基酸和必需微量元素。有降低血糖的功能，可以抗氧化和延緩衰老，被稱為“中華神菇”[1,2]。

鮮味劑又稱風(fēng)味增強(qiáng)劑，可以增強(qiáng)食品的原有風(fēng)味。“鮮味”為第5種基本口味，鮮味的產(chǎn)生主要?dú)w因于游離氨基酸和呈味核苷酸[3]，其中谷氨酸鈉和5′-核苷酸具有協(xié)同效應(yīng)[4,5]，這種協(xié)同效應(yīng)不僅是簡(jiǎn)單的相加,而是相乘作用[6]，使茶樹(shù)菇的鮮味增加數(shù)倍，是制作鮮味劑的良好原料。

崔文甲等人用超聲波輔助提取工藝研究了不同條件對(duì)金針菇、香菇菇柄中游離氨基酸的影響[7]。郭磊等人通過(guò)單因素和響應(yīng)面法對(duì)美味牛肝菌的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了萃取和優(yōu)化[8]，但關(guān)于茶樹(shù)菇風(fēng)味物質(zhì)的研究較少。且目前國(guó)內(nèi)外對(duì)茶樹(shù)菇的研究主要集中在多糖活性物質(zhì)的提取[9,10]，對(duì)其呈味物質(zhì)的釋放和提取卻鮮有報(bào)道。本文以茶樹(shù)菇為原料，采用超聲波輔助酶解法為主的方法釋放呈味氨基酸和核苷酸成分，復(fù)配后采用冷凍干燥工藝，制作符合大眾口味的調(diào)味料。此研究為茶樹(shù)菇呈味物質(zhì)的提取提供了技術(shù)參數(shù)，應(yīng)用于調(diào)味品行業(yè)，促進(jìn)了鮮味劑的發(fā)展，并為茶樹(shù)菇綜合利用和深加工提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶樹(shù)菇：市售；木瓜蛋白酶(食品級(jí)，800 U/mg)、5′-磷酸二酯酶(食品級(jí)，24000 U/g)：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑：均為分析純，市售。

電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；ALC-210A分析天平 上海分析儀器廠；UV-5500PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ抽濾機(jī) 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新志生物科技股份有限公司。

1.2 原料預(yù)處理

將新鮮茶樹(shù)菇清洗干凈，于45 ℃烘干后，粉碎過(guò)40目篩[11]，菇粉裝袋置于干燥條件下保存?zhèn)溆?。稱取一定量處理好的菇粉20 g加入400 mL蒸餾水中浸泡，經(jīng)超聲處理后在一定溫度和時(shí)間下用熱水浸提得茶樹(shù)菇水提物[12,13]，抽濾，取濾液中的上清液備用。

1.3 茶樹(shù)菇呈味氨基酸的提取

1.3.1 α-氨基酸含量的測(cè)定

式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的氨基酸的質(zhì)量濃度，V為稀釋后的樣品體積，M為樣品的總質(zhì)量。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

每次量取5 mL處理好的菇液，分別研究呈味氨基酸提取過(guò)程中加酶量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%)、酶解時(shí)間(40,60,80,100,120,140 min)、酶解溫度(40,45,50,55,60,65 ℃)、初始pH(4,5,6,7,8,9)對(duì)茶樹(shù)菇中呈味氨基酸提取率的影響。

1.3.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究加酶量(A)、酶解溫度(B)、初始pH值(C)、酶解時(shí)間(D)對(duì)α-氨基酸得率的影響，建立L9(34)正交表，優(yōu)化木瓜蛋白酶的最佳水解工藝，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal test

1.4 茶樹(shù)菇呈味核苷酸的提取

1.4.1 5′-核苷酸含量的測(cè)定

式中：C1為無(wú)機(jī)磷的質(zhì)量濃度,n為樣液的稀釋倍數(shù)。

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

每次量取10 mL處理好的菇液，分別研究呈味核苷酸提取過(guò)程中加酶量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%)、酶解時(shí)間(90,100,110,120,130,140 min)、酶解溫度(35,40,45,50,55,60 ℃)、初始pH(3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0)對(duì)茶樹(shù)菇中呈味核苷酸提取率的影響。

1.4.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取加酶量(A)、酶解溫度(B)、初始pH(C)、酶解時(shí)間(D)為實(shí)驗(yàn)因素，建立L9(34)正交表，做四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定含量，確定5′-磷酸二酯酶的最佳酶解工藝，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of orthogonal test

1.5 鮮味劑的制作

工藝過(guò)程(參考沈文鳳等[16]的方法)：將茶樹(shù)菇清洗、烘干后，粉碎過(guò)篩，加入酶試劑水解，得到水解液，向其中加入調(diào)味物質(zhì)調(diào)味后，將其干燥濃縮并造粒得到鮮味劑成品，并測(cè)定成品中α-氨基酸和5′-核苷酸的含量。

2 結(jié)果分析

2.1 茶樹(shù)菇呈味氨基酸的提取

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

以谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，OD560處的吸光度值為縱坐標(biāo)，對(duì)散點(diǎn)圖通過(guò)線性回歸繪制α-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0277X-1.9719，R2=0.9905，表明該曲線線性良好，可用于計(jì)算α-氨基酸的含量。

圖1 α-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of α-amino acid

2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.2.1 加酶量對(duì)水解效果的影響

在酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為100 min，初始pH為6.0的條件下，考察0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%的加酶量對(duì)茶樹(shù)菇氨基酸得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 木瓜蛋白酶加酶量對(duì)α-氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of the additive amount of papain on α-amino acid content

由圖2可知，α-氨基酸的含量隨著加酶量的增加而上升，超過(guò)0.25%時(shí)，曲線基本與橫坐標(biāo)平行，即α-氨基酸的含量增加速度緩慢，基本與加酶量為0.25%時(shí)的含量一致，這可能是因?yàn)樵诿噶枯^少時(shí)，水解液中的反應(yīng)物與加入的酶結(jié)合完全，酶解速率呈正比增加，使細(xì)胞壁破裂更完全，內(nèi)容物流出[17]，而在反應(yīng)物濃度不變、酶量較多時(shí)，酶過(guò)量使一部分酶不參加酶解反應(yīng)，也有可能隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，底物濃度的下降和終產(chǎn)物的增加對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用。所以，選擇木瓜蛋白酶的最優(yōu)加酶量為0.25%。

2.1.2.2 酶解溫度對(duì)水解效果的影響

在加酶量為0.2%，酶解時(shí)間為100 min，初始pH為6.0的條件下，研究40，45，50，55，60，65 ℃的酶解溫度對(duì)茶樹(shù)菇水解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 木瓜蛋白酶酶解溫度對(duì)α-氨基酸含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature of papain on α-amino acid content

由圖3可知，α-氨基酸的含量隨溫度的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，55 ℃時(shí)達(dá)到頂峰，在55～65 ℃內(nèi)，α-氨基酸的含量呈下降趨勢(shì)，這是由于在一定溫度內(nèi)，木瓜蛋白酶的活性與溫度成正比，隨溫度升高而增大，并酶解了細(xì)胞壁上的大分子糖蛋白，使細(xì)胞中的內(nèi)容物更多地流出，但當(dāng)溫度超過(guò)酶的最適溫度后，酶的活性降低，水解作用減弱，使水解液中的內(nèi)容物減少，α-氨基酸的含量也減少[18]，所以應(yīng)選55 ℃為最優(yōu)酶解溫度。

2.1.2.3 初始pH對(duì)水解效果的影響

在加酶量為0.2%，酶解時(shí)間為100 min，酶解溫度為45 ℃的條件下，研究4，5，6，7，8，9的初始pH對(duì)茶樹(shù)菇酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 木瓜蛋白酶初始pH對(duì)α-氨基酸含量的影響Fig.4 Effect of initial pH value of papain on α-amino acid content

由圖4可知，α-氨基酸的含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，α-氨基酸的含量在pH為6時(shí)達(dá)到最大值，之后含量逐漸下降，這是由于酸堿性與酶最適條件的不匹配，使酶的活性降低甚至部分失活，酶解速率下降，α-氨基酸的含量也隨之下降，所以應(yīng)選擇6為酶解反應(yīng)的最優(yōu)pH值。

2.1.2.4 酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響

在加酶量為0.2%，酶解溫度為45 ℃，初始pH為6.0的條件下，研究40，60，80，100，120，140 min的酶解時(shí)間對(duì)茶樹(shù)菇酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 木瓜蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)α-氨基酸含量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time of papain on α-amino acid content

由圖5可知，在酶解時(shí)間為40～140 min內(nèi)，α-氨基酸的含量基本呈先迅速增大后緩慢增長(zhǎng)至平穩(wěn)狀態(tài)的趨勢(shì)，在120 min后，α-氨基酸的含量基本不變，為酶解時(shí)間在40 min時(shí)所得含量的1.4倍，這是因?yàn)殡S著時(shí)間的加長(zhǎng)，細(xì)胞壁破裂更完全，同時(shí)蛋白質(zhì)水解率也隨之增大，使其快速轉(zhuǎn)換為氨基酸和多肽，當(dāng)時(shí)間達(dá)到某值后，底物反應(yīng)完全，即使增大酶解時(shí)間，也不會(huì)水解出更多的α-氨基酸，所以從經(jīng)濟(jì)效益的角度出發(fā)，應(yīng)選120 min為最優(yōu)酶解時(shí)間。

2.1.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

以α-氨基酸得率為指標(biāo)，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)，對(duì)木瓜蛋白酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析表見(jiàn)表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test

續(xù) 表

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis

由表3中極差R值和K值可知，對(duì)茶樹(shù)菇中α-氨基酸得率影響的主次因素依次是B>C>A>D，即酶解溫度>初始pH>加酶量>酶解時(shí)間，提取茶樹(shù)菇中α-氨基酸的最佳工藝參數(shù)是A2B2C1D1,即加酶量0.25%，酶解溫度55 ℃，初始pH 5，酶解時(shí)間100 min。由表4可知，酶解溫度對(duì)α-氨基酸得率的影響最為顯著，初始pH的影響較為顯著,對(duì)最佳工藝參數(shù)進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，α-氨基酸含量平均值為3.824 g/100 g，高于單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)中的任一結(jié)果。這一結(jié)果高于高珊等[19]采用茚三酮比色法測(cè)定雙酶酶解提取茶樹(shù)菇中α-氨基酸的含量(0.38 g/100 g)，這可能是因?yàn)槌曒o助水提法較纖維素酶破壁更完全，且我們?cè)跍y(cè)定α-氨基酸含量時(shí)采用了谷氨酸制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，比以甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)溶液更能準(zhǔn)確地代表α-氨基酸的含量。

2.2 茶樹(shù)菇呈味核苷酸的提取

2.2.1 5′-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

以磷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，OD660處的吸光度值為縱坐標(biāo)，對(duì)散點(diǎn)圖通過(guò)線性回歸繪制α-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖6可知，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0516X-0.0108，R2=0.9956，表明該曲線線性良好，可用于計(jì)算 5′-核苷酸的含量。

圖6 5′-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of 5′-nucleotide

2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1 加酶量對(duì)水解效果的影響

在酶解溫度為40 ℃，酶解時(shí)間為130 min,初始pH為4.0的條件下，研究0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%的加酶量對(duì)茶樹(shù)菇酶解效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 加酶量對(duì)5′-核苷酸含量的影響Fig.7 Effect of enzyme amount on 5′-nucleotide content

由圖7可知，5′-核苷酸的含量與加酶量呈正相關(guān)，在加酶量為0.1%～0.3%范圍內(nèi)，曲線斜率大，5′-核苷酸含量增長(zhǎng)迅速，當(dāng)加酶量超過(guò)0.3%時(shí)，5′-核苷酸含量基本與加酶量為0.3%時(shí)的含量一致，這可能是因?yàn)?′-磷酸二酯酶在低濃度酶的作用下與底物成比例結(jié)合，將底物分解完全，而酶濃度較高時(shí)，底物與酶不能完全飽和[20]，使酶的催化酶解作用不能完全起效。所以從經(jīng)濟(jì)方面考慮，選擇5′-磷酸二酯酶的最優(yōu)加酶量為0.3%。

2.2.2.2 酶解溫度對(duì)水解效果的影響

在加酶量為0.2%，初始pH為4.0,酶解時(shí)間為130 min的條件下，研究35，40，45，50，55，60 ℃的酶解溫度對(duì)茶樹(shù)菇酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 酶解溫度對(duì)5′-核苷酸含量的影響Fig.8 Effect of enzymolysis temperature on 5′-nucleotide content

由圖8可知，在溫度為35～60 ℃范圍內(nèi)，5′-核苷酸的含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，在酶解溫度為55 ℃達(dá)最高值，之后5′-核苷酸的含量逐漸減少，這可能是溫度較低時(shí)，酶的活性相對(duì)較低，酶解能力弱；而溫度過(guò)高時(shí)，酶空間結(jié)構(gòu)被破壞，酶解能力也降低，所以應(yīng)選55 ℃為最佳酶解溫度。

2.2.2.3 初始pH對(duì)水解效果的影響

在加酶量為0.2%，酶解溫度為40 ℃,酶解時(shí)間為130 min的條件下，研究3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0的初始pH對(duì)茶樹(shù)菇酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 初始pH對(duì)5′-核苷酸含量的影響Fig.9 Effect of initial pH on 5′-nucleotide content

由圖9可知，pH對(duì)酶影響顯著，5′-核苷酸的含量隨著pH值的升高呈先快速增大后快速減小的趨勢(shì)，在pH為5.0時(shí)，5′-核苷酸的含量達(dá)到最大值，這可能是因?yàn)槊笇?duì)pH值的變化很敏感，pH值的過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響酶的分子構(gòu)象。同時(shí)pH值的變化對(duì)水解液中反應(yīng)物的解離也有影響，從而使底物與酶的結(jié)合情況有所變化,5′-核苷酸的含量也隨之下降，所以應(yīng)選擇5.5為酶解反應(yīng)的最優(yōu)pH值。

2.2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響

在加酶量為0.2%，初始pH為4.0,酶解溫度為40 ℃的條件下，研究90，100，110，120，130，140 ℃的酶解溫度對(duì)茶樹(shù)菇酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 酶解時(shí)間對(duì)5′-核苷酸含量的影響Fig.10 Effect of enzymolysis time on 5′-nucleotide content

由圖10可知，在酶解時(shí)間為90～140 min內(nèi)，5′-核苷酸的含量隨著酶解時(shí)間的增加呈先迅速升高后緩慢增長(zhǎng)至平穩(wěn)狀態(tài)的趨勢(shì)，在時(shí)間為120 min時(shí)5′-核苷酸的含量較高，比90 min時(shí)升高了1.7倍，且120 min后，時(shí)間對(duì)酶解速率的影響不再顯著，所以從經(jīng)濟(jì)效益的角度出發(fā)，應(yīng)選120 min為最優(yōu)酶解時(shí)間。

2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

以水解液中5′-核苷酸的含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)，對(duì)5′-磷酸二酯酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析表見(jiàn)表6。

表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of orthogonal test

表6 方差分析表Table 6 Variance analysis

由表5中的極差R值和K值可知，對(duì)茶樹(shù)菇中5′-核苷酸得率影響的主次因素依次是C>A>B>D，即初始pH>加酶量>酶解溫度>酶解時(shí)間，提取茶樹(shù)菇中5′-核苷酸的最佳工藝參數(shù)是A1B1C3D3,即加酶量0.25%，酶解溫度50 ℃，初始pH 5.5，酶解時(shí)間130 min。由表6可知，初始pH對(duì)α-氨基酸得率的影響最為顯著，加酶量的影響較為顯著,對(duì)最佳工藝參數(shù)進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，5′-核苷酸含量平均值為0.74 g/100 g，高于單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)中的任一結(jié)果。這一結(jié)果低于崔茉麗[21]采用高氯酸法測(cè)定研磨法提取茶樹(shù)菇中核苷酸的含量(6.94%),這與采取的測(cè)量方法和提取方法有關(guān)，對(duì)比酶法而言，研磨珠可能使細(xì)胞壁乃至細(xì)胞核破裂完全，其中核苷酸類物質(zhì)可以最大限度地溶出，從而得率較高。

2.3 鮮味劑的制作

得到淺黃色顆粒，大小均勻[22]，可溶于水，溶于水后溶液呈淡黃色澄清透明狀，味道鮮美,具有茶樹(shù)菇的芳香氣味，經(jīng)檢測(cè)，其中α-氨基酸含量為3.81 g/100 g,5′-核苷酸含量為0.72 g/100 g。

3 結(jié)論

由單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定了木瓜蛋白酶和5′-磷酸二酯酶提取茶樹(shù)菇中呈味物質(zhì)的最佳工藝條件，木瓜蛋白酶的最優(yōu)酶解條件為：加酶量0.25%，酶解溫度55 ℃,初始pH 5，酶解時(shí)間100 min,α-氨基酸得率為3.82 g/100 g，5′-磷酸二酯酶的最佳酶解條件為:加酶量0.25%，酶解溫度50 ℃，初始pH 5.5，酶解時(shí)間130 min，5′-核苷酸得率為0.74 g/100 g。并通過(guò)調(diào)配冷凍干燥等技術(shù)將其制作成鮮味劑，呈現(xiàn)了茶樹(shù)菇味道鮮美的特點(diǎn)。